Structural and functional insights into the initial steps of phenazine biosynthesis
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Date
2011-09-22
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Eine relativ große Zahl von Bakterienstämmen produziert und sezerniert Derivate
von stickstoffhaltigen aromatischen Metaboliten der Phenazingruppe. Nach den
Ergebnissen früherer Untersuchungen wurde angenommen, dass Phenazinproduzenten
diese Verbindungen lediglich als redoxaktive Antibiotika zur Steigerung
ihrer Kompetitionsfähigkeit einsetzen. Neuere Studien zeigen jedoch, dass Phenazine
noch andere physiologische Funktionen besitzen. So können sie als Signalmoleküle
wirken und unter anoxischen Bedingungen, z.B. in den tieferen Schichten von Biofilmen,
als respiratorische Pigmente eingesetzt werden, wodurch die Größe und Form von
Bakterienkolonien beeinflusst wird. So tendieren die Bakterien in phenazindefizienten
Pseudomonas-Kolonien dazu, sich stärker auszubreiten, um direkten Kontakt mit
Luftsauerstoff zu erhalten. Weil die Phenazinbiosynthese fast ausschließlich auf
Eubakterien beschränkt ist, sind die in diesen Prozess involvierten Enzyme potentiell
attraktive Angriffspunkte für die pharmakologische Intervention.
Chorismat ist das Vorläufermolekül für eine große Zahl von primären und
sekundären Metaboliten in Bakterien und Pflanzen, z.B. für die aromatischen
Aminosäuren, für Ubichinon, Folat (Vitamin B9), Menachinon (Vitamin K), die
Siderophore Enterobactin und Pyochelin sowie für die Phenazine. PhzE verwendet
Chorismat und Glutamin zur Erzeugung von 2-Amino-2-desoxyisochorismat (ADIC) im
ersten Schritt der Phenazinbiosynthese. Im folgenden Schritt wird ADIC dann von der
Isochorismat-Pyruvat-Lyase PhzD in trans-2,3-Dihydro-3-hydroxyanthranilat (DHHA)
umgewandelt.
In dieser Arbeit wurden die Kristallstrukturen von PhzE und PhzD sowohl in der
freien als auch in der liganden- bzw. subtratgebundenen Form bestimmt. Während der
Fokus in der Untersuchung der biologischen Funktion und von potentiellen
regulatorischen Mechanismen von PhzE mittels einer Kombination aus biochemischen
und biophysikalischen Methoden bestand, wurden auch neue Einblicke in den
Substratbindungsmechanismus von PhzD gewonnen. Die erhaltenen Daten erweitern
das Spektrum der strukturell charakterisierten chorismat-verwendenden Enzyme um
ADIC-Synthasen. Außerdem vermitteln die strukturellen und funktionellen
Untersuchungen an diesen beiden Proteinen neue Einblicke in die ersten Schritte der
Phenazinbiosynthese und könnten so zukünftige Untersuchungen an möglichen
Regulationsmechanismen dieses Weges leiten.
Struktur und Funktion von PhzE
PhzE verwendet Chorismat und Glutamin, um im ersten Schritt der Phenazinbiosynthese
2-Amino-2-desoxyisochorismat (ADIC) zu erzeugen. Das Monomer von
PhzE enthält sowohl eine chorismat-umwandelnde Menachinon-Siderophor-
Tryptophan-Biosynthese- (MST) als auch eine Typ-1-Glutamin-Amidotransferase-
Domäne (GATase 1), welche durch einen 45 Aminosäure langen Linker miteinander
verbunden sind. In dieser Arbeit werden die Kristallstrukturen von PhzE aus
Burkholderia lata 383 in einer ligandenfreien offenen und in einer ligandengebundenen
geschlossenen Konformation bei 2.9 bzw. 2.1 Å Auflösung vorgestellt.
PhzE formt ein überkreuztes Dimer, in dem die GATase-1-Domäne der einen Kette
NH3 für die MST-Domäne der anderen Kette erzeugt. Diese Quartärstruktur wurde auch
durch Kleinwinkel-Röntgenstreuungsexperimente bestätigt. Die Bindung von Chorismat,
das in der Kristallstruktur in Benzoat und Pyruvat umgewandelt vorgefunden wurde,
führt zu strukturellen Umlagerungen unter Ausbildung eines Ammoniak-Transportkanals
von 25 Å Länge innerhalb jedes der beiden funktionalen MST/GATase1-Paare des
Dimers. Die funktionelle Einordnung von PhzE als ADIC-Synthase wurde durch
massenspektrometrische Analyse des Produkts bestätigt. Dieses konnte auch durch
Abfangen in Kristallen von inaktiven Mutanten (D38A/D38N) von PhzD, einer
Isochorismatase, die den nachgelagerten Schritt in der Phenazinbiosynthese katalysiert,
bei 1.9 Å sichtbar gemacht werden.
Enzymkinetische Michaelis-Menten-Parameter für den Umsatz von Chorismat durch
PhzE wurden bestimmt und zeigen, dass PhzE ein ähnliches Aktivitätsniveau wie
andere Mitglieder der MST-Familie besitzt. Mutageneseexperimente wurden
durchgeführt, um einerseits Aminosäuren, die an der Aufrechterhaltung der Stabilität
bzw. Funktion von PhzE beteiligt sind, zu identifizieren und um anderseits Unterschiede
in der ersten Substratkoordinationssphäre von Chorismat zwischen PhzE und
Anthanilatsynthasen (AS) zu untersuchen. Im Gegensatz zu den verwandten
Anthranilatsynthasen wurde bei PhzE keine allosterische Inhibition festgestellt. Dies ist
darauf zurückzuführen, dass ein Tryptophan die potentielle regulatorische Bindungsstelle
blockiert. Zusätzliche Elektronendichte im aktiven Zentrum der GATase1 wurde
als Zink identifiziert und es wurde gezeigt, dass Zn2+, Mn2+ und Ni2+ die Aktivität von
PhzE verringern.
Kristallstrukturen von PhzD und Implikationen für den Substratbindungsmechanismus
PhzD ist eine Isochorismatase, die den zweiten Schritt der Phenazinbiosynthese
katalysiert, indem sie die Vinylethergruppe von ADIC unter Erzeugung von trans-2,3-
Dihydro-3-hydroxyanthranilat (DHHA) und Pyruvat hydrolysiert. Das Enzym besteht aus
einer einzigen Kette mit 209 Aminosäuren, die zu einer a/ß-Struktur mit Ähnlichkeit zu
Mitgliedern der a/ß-Hydrolasefamilie faltet.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine umfassende kristallografische Untersuchung
durchgeführt. Kristallstrukturen von nativem PhzD in seiner ligandenfreien Form und im
Komplex mit Cacodylat und Acetat sowie mit seinem Produkt DHHA wurden bestimmt.
Die beiden inaktiven Mutanten PhzD-D38A und PhzD-D38N im Komplex mit ADIC
wurden ebenfalls kristallisiert. Dies ist das erste Mal, dass sowohl das natürliche
Substrat und Produkt von PhzD in Kristallstrukturen beobachtet wurden. Die Ergebnisse
bestätigen nicht nur die ADIC-Synthasefunktion von PhzE, sondern liefern auch Einblick
in die Substratbindemechanismen von PhzD. Eine Gruppe von Aminosäuren, die in die
Koordination des Substrats und in die Reaktionskatalyse verwickelt sind, wurde
identifiziert. Interessanterweise ist die Schleifenregion P79 – R87 in der ligandenfreien
Struktur sehr flexibel und in der Elektronendichtekarte vollständig unsichtbar. Der
Strukturvergleich zwischen ligandenbesetzter und freier Struktur zeigt an, dass diese
Schleife als ein Torwächter fungiert, der den Zu- und Abgang des Substrats kontrolliert.
Description
Table of contents
Keywords
Natural products, Phenazines, X-ray crystallography