Miniaturised nucleic acid analysis systems
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Date
2008-06-25T08:29:03Z
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Abstract
The design and implementation of miniaturised systems for analysis of nucleic acids from various biological samples has undergone extensive development. Several advances have been made particularly with the integration of nucleic acid amplification and detection, where amplification is most often polymerase chain reaction (PCR). Sample preparation remains a major obstacle for achieving a quantitative analysis employing full miniaturised integration. Miniaturised devices for nucleic acid sample preparation, amplification and detection have to be further developed in order to achieve a fully integrated system, which ultimately can perform single cells genomic analysis with sample-in-answer-out ability. In this thesis, three miniaturised systems have been presented, which can be used for purification and preconcentration of DNA, pre-amplification and long-term storage of DNA, and amplification with real-time detection of DNA, respectively. The first miniaturised system applies isotachophoresis for pretreatment of DNA, where the DNA sample can be purified and concentrated using a discontinuous electrolyte system. Both qualitative and quantitative information can be acquired simultaneously. The second miniaturised system employs simple isothermal multiple displacement amplification, (MDA) for whole genome amplification (WGA) of human genomic DNA. The miniaturised WGA process showed a high efficiency of 95.8%, and the fidelity of the amplified products is extremely high as suggested by single-nucleotide polymorphisms analysis. For the last system, we developed a bidirectional shunting PCR microdevice equipped with real-time fluorescence detection, which allows higher flexibility and fast thermocycling by combining both advantages of stationary PCR and continuous-flow PCR. Real-time monitoring of RNase P PCR amplification from lower concentration human genomic DNA down to ~24 copy numbers or 12 cells was achieved. The three systems described in this thesis can be readily adapted to current reported miniaturised platforms. Such a fully integrated device capable of quantitative nucleic acid analysis remains an enigma, and with further development will represent significant importance for the development of point-of-care device.
Das Design und die Implementierung miniaturisierter Systeme für die Analyse von Nukleinsäuren aus verschiedenen biologischen Proben haben eine beträchtliche Entwicklung erlebt. Fortschritte wurden insbesondere bei der Integration der Nukleinsäure-Vervielfältigung und -Detektion gemacht, wobei die Vervielfältigung meistens auf der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) beruht. Die Probenvorbereitung bleibt ein Haupthemmnis bei dem Versuch, eine quantitative Analyse mit vollständig miniaturisierten Systemen zu verwirklichen. Miniaturisierte Geräte für die Probenvorbereitung, Vervielfältigung und Detektion von Nukleinsäuren müssen weiter entwickelt werden, um ein vollständig integriertes System zu verwirklichen, das letztendlich in der Lage ist, die Genomanalyse einzelner Zellen mit "sample-in-answer-out"-Fähigkeit durchzuführen. In dieser Arbeit werden drei miniaturisierte Systeme präsentiert, die jeweils für die DNA-Aufreinigung und -Vorkonzentrierung, deren Vor-Vervielfältigung und Langzeit-Speicherung bzw. der Vervielfältigung mit Echtzeitdetektion von DNA verwendet werden können. Das erste miniaturisierte System nutzt die Isotachophorese zur Vorbehandlung der DNA, bei der die DNA-Probe in einem diskontinuierlichen Elektrolytsystem gereinigt und aufkonzentriert werden kann. Dabei können sowohl qualitative als auch quantitative Informationen simultan aufgenommen werden. Das zweite miniaturisierte System verwendet die simple Methode der isothermischen Multiplen Displacement Amplification (MDA) für die Vervielfältigung des gesamten Genoms (Whole Genome Amplification, WGA) der humanen, genomischen DNA. Der miniaturisierte WGA-Prozess zeigte eine hohe Effizienz von 95,8% und die Wiedergabetreue des vervielfachten Produkts ist extrem hoch, was durch die Ergebnisse einer Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Analyse angedeutet wurde. Für des letzte System entwickelten wir ein kleines bidirektionales shunting-PCR-Instrument, in dem die injizierte DNA durch eine temperierte Zone mehrfach hin und her verschoben wird. Ausgestattet mit einem Fluoreszens Detektor, erreicht man eine höhere Flexibilität und schelle Temperaturzyklen, und kombiniert so die Vorteile der stationären PCR und der Durchfluss-PCR. Eine Echtzeitdetektion der RNase-P-PCR-Vervielfältigung von niedrig konzentrierter, humaner genomischer DNA mit einem Minimum von ~24 Kopien oder 12 Zellen wurde erreicht. Die drei in dieser Arbeit beschriebenen Systeme können direkt an aktuelle miniaturisierte Aufbauten angepasst werden. Ein solches vollständig integriertes, zur quantitativen Nukleinsäure-Analyse fähiges Gerät bleibt ein Mysterium, und zusammen mit weiteren Verbesserungen wäre es von großer Bedeutung für die Entwicklung von point-of-care Geräten.
Das Design und die Implementierung miniaturisierter Systeme für die Analyse von Nukleinsäuren aus verschiedenen biologischen Proben haben eine beträchtliche Entwicklung erlebt. Fortschritte wurden insbesondere bei der Integration der Nukleinsäure-Vervielfältigung und -Detektion gemacht, wobei die Vervielfältigung meistens auf der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) beruht. Die Probenvorbereitung bleibt ein Haupthemmnis bei dem Versuch, eine quantitative Analyse mit vollständig miniaturisierten Systemen zu verwirklichen. Miniaturisierte Geräte für die Probenvorbereitung, Vervielfältigung und Detektion von Nukleinsäuren müssen weiter entwickelt werden, um ein vollständig integriertes System zu verwirklichen, das letztendlich in der Lage ist, die Genomanalyse einzelner Zellen mit "sample-in-answer-out"-Fähigkeit durchzuführen. In dieser Arbeit werden drei miniaturisierte Systeme präsentiert, die jeweils für die DNA-Aufreinigung und -Vorkonzentrierung, deren Vor-Vervielfältigung und Langzeit-Speicherung bzw. der Vervielfältigung mit Echtzeitdetektion von DNA verwendet werden können. Das erste miniaturisierte System nutzt die Isotachophorese zur Vorbehandlung der DNA, bei der die DNA-Probe in einem diskontinuierlichen Elektrolytsystem gereinigt und aufkonzentriert werden kann. Dabei können sowohl qualitative als auch quantitative Informationen simultan aufgenommen werden. Das zweite miniaturisierte System verwendet die simple Methode der isothermischen Multiplen Displacement Amplification (MDA) für die Vervielfältigung des gesamten Genoms (Whole Genome Amplification, WGA) der humanen, genomischen DNA. Der miniaturisierte WGA-Prozess zeigte eine hohe Effizienz von 95,8% und die Wiedergabetreue des vervielfachten Produkts ist extrem hoch, was durch die Ergebnisse einer Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Analyse angedeutet wurde. Für des letzte System entwickelten wir ein kleines bidirektionales shunting-PCR-Instrument, in dem die injizierte DNA durch eine temperierte Zone mehrfach hin und her verschoben wird. Ausgestattet mit einem Fluoreszens Detektor, erreicht man eine höhere Flexibilität und schelle Temperaturzyklen, und kombiniert so die Vorteile der stationären PCR und der Durchfluss-PCR. Eine Echtzeitdetektion der RNase-P-PCR-Vervielfältigung von niedrig konzentrierter, humaner genomischer DNA mit einem Minimum von ~24 Kopien oder 12 Zellen wurde erreicht. Die drei in dieser Arbeit beschriebenen Systeme können direkt an aktuelle miniaturisierte Aufbauten angepasst werden. Ein solches vollständig integriertes, zur quantitativen Nukleinsäure-Analyse fähiges Gerät bleibt ein Mysterium, und zusammen mit weiteren Verbesserungen wäre es von großer Bedeutung für die Entwicklung von point-of-care Geräten.
Description
Table of contents
Keywords
Miniaturisation, Nucleic acid, Isotachophoresis, Polymerase chain reaction, Whole genome amplification, Real-time detection