Regulation of septin filament formation and cholesterol production by DHCR7
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Date
2013-05-07
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Elektronenmikroskopie (EM) ist eine hervorragende Methode um die Struktur von Proteinkomplexen in
ihrer nativen Umgebung zu studieren. In dieser Arbeit verwendeten wir zum einen
Einzelpartikelelektronenmikroskopie und Elektronenktomographie um die Struktur von Septinfilamenten
und deren Interaktion mit anderen Proteinen zu untersuchen. Zum anderen züchteten wir
zweidimensionale Kristalle der Dehydrocholesterinreduktase DHCR7, um in Zukunft deren Struktur
elektronenkristallographisch bestimmen zu können.
Septine gehören zur Familie der GTPasen und bilden große Polymere, deren Untereinheiten aus nichtpolaren
Multimeren bestehen. Die Polymere wiederum bilden Filamente, die im Knospungshals von
sprossenden Hefen zu finden sind. Die Rekrutierung der Septine zum Knospungshals ist abhängig von
dem Signalprotein Cdc42p und zwei seiner Effektoren, Gic1 und Gic2. Die Septinfilamente lagern sich
auf der Oberfläche von Membranen an und bilden dadurch zum einen ein Gerüst und zum anderen eine
Diffusionsbarriere für Proteine. Obwohl man weiß, dass Gic-Proteine direkt mit Septinen interagieren,
sind die strukturellen Gegebenheiten und die Signifikanz dieser Bindung bislang unbekannt.
In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass Gic1 an der Bindungsfläche zwischen den Septinen Cdc10-
Cdc10 bindet und dabei bis zu sechs Septin-Filamente zu einem flexiblen Septin-Gic-Komplex verbindet.
Die Bindung von Cdc42p(GDP) an die ersten 29 Aminosäuren von Cdc10 induziert die Dissoziierung der
Septinfilamente. Cdc42p(GppNHp) hingegen interagiert nicht mit Septinen, sondern bindet direkt an
Gic1. Interessanterweise führen hohe Konzentrationen von Cdc42p(GppNHp) dabei zu einer
Dissoziierung des Septin-Gic-Komplexes. Ebenso haben wir den Effekt von GTP auf die Filamente selbst
untersucht. GTP ersetzt GDP in Cdc11 und verursacht eine Konformationsänderung an der
Bindungsfläche von Cdc11-Cdc11 was zu einer Dissoziierung der Septinfilamente führt. Die vorliegende
Studie liefert ein Modell für den durch Cdc42p, GTP und Gic1 gesteuerte Auf- und Abbaus von
Septinringen während des Zellzyklus.
Die Dehydrocholesterinreduktase DHCR7 reduziert im letzten Schritt der Cholesterin-Biosynthese die
C7-C8-Doppelbindung von 7-Dehydrocholesterin unter Verbrauch von NADPH. Eine Fehlfunktion der
DHCR7 führt beim Menschen zu dem Smith-Lemli-Opitz Syndrom (SLOS). Eine atomare Struktur der
DHCR7, die es bislang nicht gibt, würde die mechanistischen Grundlagen der enzymatischen Funktion
des Proteins erklären und Aufschlüsse über dessen Fehlsteuerung im Krankheitsfall geben.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich deshalb mit der Isolierung, Aufreinigung und zweidimensionalen
Kristallisation der menschlichen Dehydrochlosterinreduktase-7 und deren bakteriellen Homologe aus
Coxiella burnettii und Plesiocystis pacifica.
Für DHCR-7 aus Coxiella burnettii konnten kleine zweidimensionale gezüchtet werden, die allerdings in
Zukunft verbessert werden müssen, um sie elektronenkristallographisch zu analysieren. Um die Funktion
der Reduktase in vivo zu studieren, wurde die DHCR-7-katalysierte Umwandlung von Ergosterol zu
Brassicasterol mit Hilfe von Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS)quantifiziert. Des Weiteren zeigte eine Lokalisationsstudie in HEK293-Zellen, dass DHCR7 neben dem ER auch im Golgi-Apparat lokalisiert ist.
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Keywords
Cholesterol, Electron microscopy, Filament, Septin