Structural studies on human RZZ and Cln3p

Abstract

Die vorliegende Dissertation ist in zwei Thematiken unterteilt: 1.Molekulare Mechanismen der Segregation von Chromosomen: Die Segregation der Chromosomen ist ein zentraler Prozess während der Zellteilung. Dieser wird durch hierarchische Proteinkomplexe reguliert, die Kinetochore. Sie kontrollieren die synchrone Teilung der Schwesterchromatiden in höheren Eukaryoten in einem Prozess, der als spindle assembly checkpoint (SAC) bezeichnet wird. Der 800 kDa große ROD-Zw10-Zwilch (RZZ) Proteinkomplex besitzt eine Schlüsselfunktion in der Formierung des SAC sowie der Anheftung der Mikrotubuli an die Kinetochore. Diese Arbeit beschreibt die erste mittels Kryo-Elektronenmikroskopie bestimmte hochaufgelöste Struktur des RZZ Komplexes. Die Organisation der Bestandteile des Komplexes wurde durch Einbeziehung diverser biochemischer Methoden charakterisiert. Diese Arbeit stellt den ersten Schritt für ein strukturelles Verständnis des SAC dar und ermöglicht hierdurch ein besseres Verständnis der komplexen Signalwege, welche die Zellteilung steuern. 2. Molekulare Grundlagen der Batten-Krankheit: Das Ceroid-lipofuscinosis neuronal-3 (cln3) Gen kodiert für ein Transmembranprotein (Cln3p). Mutationen dieses Proteins bilden die Grundlage für die Batten-Krankheit, die am weitesten verbreitete aller neuronalen Ceroid-Lipofuscinosen (NCL). Diese vererbbaren neuronalen Krankheiten sind durch den Verlust der Sehkraft, myoklonische Anfälle, Verlust der geistigen Fähigkeiten sowie Störungen der motorischen Fertigkeiten charakterisiert. In dieser Arbeit wird die erste erfolgreiche Expression und Reinigung des humanen Cln3p mittels eines Baculovirus-Insektenzellen-Expressionssystems beschrieben. Initiale biochemische Charakterisierungen der posttranslationalen Modifikationen des Proteins wurden durchgeführt. Weiterhin wurden erste Versuche zum Aufklärung der Proteinfunktion und der Struktur des Proteins begonnen.

The work presented in this thesis can be divided into two topics: 1. Molecular mechanism of chromosome segregation: Chromosome segregation is a central process in cell division. Hierarchical protein assemblies called kinetochores navigate this process. They monitor the synchronous separation of sister chromatids in higher eukaryotes by a pathway commonly referred to as spindle assembly checkpoint (SAC). The 800 kDa ROD-Zw10-Zwilch (RZZ) complex is a key player both in SAC and formation of kinetochore – microtubule attachments. This work highlights the first high-resolution structure of the RZZ complex determined by cryo-electron microscopy. The organization of constituent proteins in the complex has been understood by interweaving various biochemical methods. This study is essentially the first step in understanding the SAC from a structural perspective and enables to use hints from the structure in understanding the complex signaling process that drives cell division. 2. Molecular basis of the Batten disease: Ceroid – lipofuscinosis neuronal-3 (cln3) gene encodes a trans-membrane protein (Cln3p) mutations in which cause Batten’s disease. Batten disease is the most common of all neuronal ceroid-lipofuscinoses (NCL, genetically inherited neuronal disorders) characterized by loss of vision, myoclonic seizures, loss of cognitive function, motor dysfunction. This work reports the first expression and purification of human Cln3p from the baculovirus driven insect cell expression system. Initial biochemical characterization of the protein is also reported. Efforts to understand the protein function have been initialized and variety of techniques used to understand the structure of the protein.