Development of small molecule modulators of stem cell reprogramming

Abstract

Accessing a large number of high quality pluripotent stem cells from differentiated cells by means of small molecule treatment, i.e. chemical reprogramming, is a prerequisite to bring stem cell technologies a step closer to clinical applications. Triamterene (TR), a pteridine-based analog, has been previously shown to convert late-stage mouse epiblast stem cells (mEpiSCs) into embryonic stem (ES)-like cells. As a continuation of the efforts to further improve the reprogramming activity, a TR-based compound collection was synthesized that culminated in the identification of Epiblastin A, which is approximately 2.3 fold more active compared to the initial hit. Since genetic and chemical inhibition of the casein kinase 1 (CSNK1) family has been previously identified as the driving force of the reprogramming process, the inhibitory activity of the compound collection against CSNK1 isoenzymes was investigated using a screening platform based on KinaseGlo® reagent. This study revealed structural features required for potent and / or selective interaction of the TR-analogs and these isoforms. Furthermore, target engagement of Epiblastin A with CSNK1A1/D/E isoenzymes was demonstrated in cell lysates obtained from HCT116 colorectal carcinoma cell line using the ActivXTM ATP probe. Moreover, additional targets addressed by Epiblastin A in HCT116 cell lysate were disclosed by means of chemical proteomics strategy using the same reagent. Among those, STK10, PIP4K2A and PIP4K2C kinases were identified and in addition STK10 was also shown to interact with Epiblastin A in cell lysates. Finally, an in vitro profiling study against 123 kinases furnished further kinase targets such as BRSK1, EEF2K, EGFR, MKNK2 and RIPK2, thus revealing potential modulators that might be involved in the chemical reprogramming mechanism.

Die chemisch induzierte Reprogrammierung von pluripotenten Stammzellen ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von klinisch relevanten Methoden und Anwendungen von Stammzellen. Die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen pluripotenten Stammzellen bildet dafür derzeitig eine wichtige Schlüsselstelle. In der Vergangenheit es wurde gezeigt dass das Pteridin-basierte Triamteren (TR) in der Lage ist Stammzellen aus Maus Epiblasten (mEpiSCs) auch aus späten Entwicklungsstadien in embryonale Stammzellen (ES) zu konvertieren. Im Zuge der TR-Optimierung in Hinblick auf eine gesteigerte Reprogrammierungsaktivität wurde Epiblastin A aus einer TR-inspirierten Substanz-bibliothek identifiziert. Epiblastin A zeigt eine 2.3-fach erhöhte Aktivität im Vergleich zum Primärhit und stellt die Grundlage für die hier weiter aufgeführten Studien. Die Ergebnisse führten zur Hypothese, dass die Casein-Kinase (CSNK1) ein wichtiges potenzielles Schlüsselenzym für den von Epiblastin A induzierten Reprogrammierungsprozess ist. Hierzu wurden TR-Analoga in einem KinaseGlo® basiertem Testsystem auf CSNK1-modulierende Aktivität getestet. Daraus wurde eine Strukturaktivitätsanalyse (SAR) aufgestellt. Im Folgenden konnte in zellbasierten Experimenten bestätigt werden, dass Epiblastin A die Aktivität der CSNK1A1/D/E Isoenzyme inhibiert. Hierzu wurde im komplexen Zelllysat der Darmkrebszelllinie (HCT116) die Wechselwirkung von Epiblastin A mit CSNK1A1/D/E Isoformen untersucht. In zusätzlichen Studien, die auf einem klassisch chemisch-proteomischen Versuchsaufbau basierten, wurden aus HCT116-Lysat zusätzliche neue Zielproteine von Epiblastin A identifiziert. Darauf basierend wurde eine Interaktion mit den Kinasen STK10, PIP4K2A und PIP4K2C postuliert und in weiterführenden zelllysatbasierten Studien konnte STK10 als neuer Interaktionspartner von Epiblastin A bestätigt werden. In einer zusätzlichen, weitangelegten in vitro Studie wurden insgesamt 123 Kinasen als mögliche Zielproteine von Epiblastin A getestet. Hierbei wurden zusätzlich BRSK1, EEF2K, EGFR, MKNK2 und RIPK2 als weitere potenzielle Interaktionspartner im Epiblastin A induzierten Reprogrammierungsprozess von mEpiSC identifiziert.