Metal-mediated DNA G-quadruplexes: spin-labeling for distance measurements in higher-order structures and new ligand functionalities for heteroleptic coordination environments

Abstract

G-quadruplexes are four-stranded secondary DNA structures formed from π-stacked tetrads of Hoogsteen hydrogen-bonded guanines. Due to their regulatory roles in biological processes G-quadruplexes have been identified as potential drug targets especially in anticancer research. Their biological and medicinal importance calls for detailed structural information on G-quadruplexes and their adducts with G-quadruplex binders. Due to their high topological diversity, structure elucidation of G-quadruplexes is challenging. Additionally, they tend to form higher-order structures like dimers which are thought to influence their function in vivo. In this thesis, artificial square-planar Cu(pyridine)4 complexes, covalently incorporated into tetramolecular G-quadruplexes, were used as highly rigid spin labels for the detection of higher-order structures by intermolecular Cu2+-Cu2+ distance measurements with pulsed dipolar EPR spectroscopy. Various G-quadruplex dimers of different spatial dimensions were unambiguously distinguished and unprecedentedly narrow distance distributions obtained in the experiments were in full agreement with MD simulation results. Moreover, the intercalation of drug-like G-quadruplex binders into G-quadruplex dimers resulting in sandwich complexes was investigated. The method was further applied to measure distances in more complex DNA constructs like duplex-bridged unimolecular G-quadruplexes. The transition metal labeling approach, combined with pulsed EPR spectroscopy, opens new possibilities for examining structures of non-covalent DNA aggregates. Furthermore, the incorporation of metal complexes into DNA structures plays an important role in DNA nanotechnology as it allows to introduce additional functionality. The covalent installation of ligand functionalities into G-quadruplex scaffolds is a promising strategy to build tailored coordination spheres within a DNA environment for transition metal complexes with fine-tuned properties. While the concept has previously been established, the variety of ligand functionalities was expanded in this thesis. Inspired by donor groups found in amino acid side chains, hard carboxylates as well as softer thioether and thiol residues were integrated in G-quadruplexes. The modularity of the approach was showcased by the variation of kind, number, and positioning of donor groups in a unimolecular G-quadruplex resulting in preorganized heteroleptic coordination environments with different metal affinities. This strategy allows the simple construction of tailored transition metal complexes for future applications in DNA nanotechnology for purposes like asymmetric catalysis or redox activity mimicking functional complexes from metallo-proteins.

G-Quadruplexe sind viersträngige DNA-Sekundärstrukturen, die aus π-gestapelten Tetraden bestehen, die sich aus Guaninen über Hoogsteen-Wasserstoffbrücken bilden. Aufgrund ihrer regulatorischen Funktion in biologischen Prozessen wurden G-Quadruplexe als potenzielle Angriffsziele für Medikamente insbesondere in der Krebsforschung identifiziert. Ihre biologische und medizinische Bedeutung erfordert detaillierte Strukturinformationen zu G-Quadruplexen und deren Addukten mit G-Quadruplexbindern. Die Strukturaufklärung von G-Quadruplexen ist aufgrund der hohen topologischen Vielfalt eine Herausforderung. Hinzu kommt, dass sie dazu neigen, übergeordnete Strukturen wie Dimere zu bilden, die die in-vivo-Funktion beeinflussen. In dieser Arbeit wurden künstliche, quadratisch-planare Cu(Pyridin)4-Komplexe kovalent in tetramolekulare G-Quadruplexe eingebaut und als hochrigide Spinmarker verwendet, um übergeordnete Strukturen durch intermolekulare Cu2+-Cu2+-Abstandsmessungen mit gepulster dipolarer EPR-Spektroskopie zu detektieren. Verschieden große G-Quadruplex-Dimere konnten zweifelsfrei voneinander unterschieden werden und aus den Experimenten erhaltene, beispiellos schmale Abstandsverteilungen stimmten sehr gut mit Ergebnissen aus MD-Simulationen überein. Zudem wurde die Interkalation wirkstoffähnlicher G-Quadruplexbinder in G-Quadruplex-Dimere untersucht, was in Sandwichkomplexen resultiert. Die Methode wurde weiter zum Messen von Abständen in komplexeren DNA-Konstrukten wie Duplex-verbrückten, unimolekularen G-Quadruplexen angewendet. Der Ansatz der Übergangsmetall-basierten Spinarkierung in Kombination mit gepulster EPR-Spektroskopie eröffnet neue Möglichkeiten zur Strukturanalyse nicht-kovalenter DNA-Aggregate. Des Weiteren spielt der Einbau von Metallkomplexen in DNA-Strukturen eine wichtige Rolle in der DNA-Nanotechnologie, da dadurch die Einführung zusätzlicher Funktionalität möglich ist. Die kovalente Installation von Donorfunktionalitäten in G-Quadruplex-Gerüste stellt eine vielversprechende Strategie dar, um maßgeschneiderte Koordinationsspheren innerhalb der DNA-Umgebung für Übergangskomplexe mit feinjustierten Eigenschaften zu bilden. Da das Konzept bereits etabliert wurde, sollte die Auswahl an Liganden in dieser Arbeit erweitert werden. Inspiriert durch Donorgruppen aus Aminosäureseitenketten wurden harte Carboxylate sowie weichere Thioether- und Thiolfunktionen in G-Quadruplexe eingebaut. Die Modularität des Ansatzes wurde durch die Variation von Art, Zahl und Position der Liganden in einem unimolekularen G-Quadruplex demonstriert, was zu vororganisierten, heteroleptischen Koordinationsumgebungen mit verschiedenen Metallaffinitäten führte. Die Strategie ermöglicht den einfachen Aufbau maßgeschneiderter Übergangsmetallkomplexe für zukünftige Anwendungen in der DNA-Nanotechnologie für Zwecke wie asymmetrische Katalyse oder Redoxaktivität durch Nachahmen von funktionellen Komplexen aus Metallo-Proteinen.