Deciphering strand-asymmetrically modified CpG dyads in the DNA double-helix

Abstract

Alle Lebewesen müssen dafür Sorge tragen, in ihrem umfangreichen Erbgut die gerade für sie überlebensnotwendigen Gene von denen zu unterscheiden, die nicht gebraucht werden. Insbesondere mehrzellige Organismen müssen diesen Prozess zellspezifisch koordinieren, trotz dessen, dass hier dieselbe Erbinformation in allen Zellen des Individuums vorliegt. Ein Mechanismus, welcher diesem Zwecke dient, ist die Modifikation von DNA-Nukleobasen, den Bausteinen des Trägers der Erbinformation.

In Säugetieren wie Mensch und Maus kommt hierbei der Methylierung der DNA-Nukleobase Cytosin am Kohlenstoffatom C5 des Pyrimidinrings eine besondere Rolle zu. Sie findet auf beiden Strängen der DNA-Doppelhelix innerhalb des kurzen Sequenzpalindroms CpG statt und trägt entscheidend dazu bei, dass hier ortsspezifisch andere molekulare Interaktionen für die Expression der Erbinformationen notwendig werden. Da das Produkt 5-Methylcytosin für weitere enzymatische Modifikationen wie der Oxidation zu 5-Hydroxymethylcytosin, 5-Formylcytosin oder 5-Carboxycytosin zur Verfügung steht, können unterschiedliche Kombinationen dieser Cytosinderivate mit gänzlich einzigartigen chemischen Eigenschaften an den komplementären CpG-Paaren im DNA-Doppelstrang vorliegen. Ein Aspekt, der unter dem Gesichtspunkt der epigenetischen Funktion dieser Derivate in Ermangelung technologischer Innovation sie in natürlichem Chromatin zu untersuchen, bislang kaum erschlossen werden konnte. Inwiefern es nun möglich ist, solche Strang-symmetrischen oder Strang-asymmetrischen Kombinationen von Cytosinderivaten in diesen CpG-Paaren auf molekularer Ebene in der DNA-Doppelhelix zu erkennen und somit gegebenenfalls zu entschlüsseln, ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit.

Ausgehend von verschiedenen Homologen einer Proteindomäne, welche symmetrisch methylierte CpG-Paare erkennen, den Methyl-CpG-bindenden Domänen (MBD), wurden aufgrund struktureller Erwägungen und funktionaler Studien der MBD–DNA-Binding, degenerierte Proteinvariantenbibliotheken erstellt. Mithilfe eines hierfür eigens entwickelten Hochdurchsatzverfahrens gelang es, Varianten zu identifizieren, die nahezu selektiv eine aus fünfzehn Paarungen obiger Cytosinderivate im DNA-Doppelstrang erkennen. Neben allgemeinen Substitutionsprofilen für verschiedene Paarungen wurden im Speziellen mehrere MBD-Varianten entdeckt, die eine neue, natürlicherweise nicht vorhandene Selektivität für 5-Hydroxymethyl- und 5-Carboxymethylcytosin-haltige CpG-Paarungen aufwiesen. Aus der weiteren biochemischen und strukturellen Charakterisierung der Bindespezifität konnten einige Erkenntnisse über die molekulare Erkennung Strang-asymmetrisch modifizierter CpG-Paarungen gewonnen werden, welche in Zukunft als Schlüssel dienen können, die epigentische Funktion der Cytosinmodifizierung im humanen Genom mithilfe solcher speziell auf sie zugeschnittenen Sonden zu entschlüsseln.