Targeting of RNA-binding proteins with macrocyclic peptides

Abstract

Die Arzneimittelforschung konzentrierte sich lange Zeit auf die Entwicklung von Modulatoren für Enzyme, da viele Enzyme zielgerichtete, kleine Taschen und katalytische Stellen aufweisen, für die kleine Moleküle auf rationale Weise entworfen oder gescreent werden konnten. Auch Protein-Protein-Wechselwirkungen, für die verschiedene chemische Räume erforscht werden mussten, wurden erfolgreich ins Visier genommen. In den letzten Jahren wurde das Interesse an vielfältigeren makromolekularen Komplexen wie Nukleinsäure Protein-Interaktionen geweckt. Bei dieser Arbeit liegt der Schwerpunkt auf der Entdeckung von Modulatoren von Protein-RNA Interaktionen. Das Projekt konzentrierte sich auf den Spleißfaktor polypyrimidine tract binding protein 1 (PTBP1), der bei Überexpression verschiedene Krankheiten wie Krebs, Herzerkrankungen, Diabetes und den Abbau von Nervenzellen verursacht. Dieses Protein besteht aus vier RNA bindenden Domänen, die unterschiedliche Konsensussequenzen mit hoher Ähnlichkeit binden und durch die Tertiärstruktur des Proteins und der RNA eine komplexe Bindung an die Ziel-RNAs ermöglichen. Zunächst wurde versucht, einen auf E. coli basierenden zellulären Assay zur Quantifizierung der Interaktion von PTBP1 mit seinen Ziel-RNAs zu entwickeln. Dieser Assay sollte verwendet werden, um eine Bibliothek genetisch kodierter Peptidmakrozyklen auf Inhibitoren dieser Interaktion zu untersuchen. Später wurde die Funktion einer kürzlich berichteten transienten α-Helix zwischen den N-terminalen Domänen von PTBP1 untersucht und genutzt, um stabilisierte Peptide zu entwickeln, die mit der nativen, in das Protein eingebetteten Helix in vitro konkurrieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Makrozyklen die Kooperativität zwischen RRM1 und RRM2 für eine RNA mit zwei Bindungsstellen hemmen. Die Peptide weisen einen einstelligen mikromolaren KI in den durchgeführten Experimenten auf. Diese Moleküle erwiesen sich als mäßig zellpermeabel, lysatstabil und modulierten das Spleißen mit geringen Auswirkungen. Darüber hinaus wurde der Bindungsmodus eines Peptids durch Ko-Kristallisation mit RRM1 validiert. In einem weiteren Projekt wurden makrozyklische Peptid-Inhibitoren für ein nicht konventionelles RNA-Bindungsprotein WDR5 strukturell untersucht, um ihre Wirkungsweise zu validieren.

Drug discovery traditionally focused on the development of modulators for enzymes for a long time because many enzymes provide targetable small pockets and catalytic sites for which small molecules could be rationally designed or screened. Also, protein-protein interactions, for which different chemical spaces needed to be explored, were targeted successfully. In the recent years the interest in more diverse macromolecular complexes like nucleic acid-protein interactions awaked interest. For this work, the focus is on the discovery of modulators of protein-RNA interactions. The project focused on the splicing factor polypyrimidine tract binding protein 1 (PTBP1) which drives several diseases including cancer, cardiac diseases, diabetes and neuronal degradation when overexpressed. This protein consists of four RNA recognition motifs which bind to distinct consensus sequences with high similarities, which orchestrate a complex binding mode to target RNAs through the tertiary structure of the protein and RNA. First, the development of an E. coli based cellular assay for the quantification of the interaction of PTBP1 with its target RNAs was attempted. This assay was planned to be used to screen a library of genetically encoded peptide macrocycles as inhibitors of this interaction. Later, the function of a recently reported transient α-helix between the N-terminal domains of PTBP1 was investigated and utilized to design stapled peptides to compete with the native helix in vitro. Here, it was shown that the macrocycles inhibit the cooperativity between RRM1 and RRM2 which compete with a single RNA molecule with two binding sites with a single digit micromolar KI. These molecules were validated to have a sufficient cell-permeability, lysate stability, and modulated splicing with low effects. Further on, the binding mode of one peptide was validated through co-crystallization with RRM1 lacking the native helix. In another project, macrocyclic peptide inhibitors for a non-conventional RNA binding protein WDR5 was structurally studied to validate their mode of action.