Identification of transcriptional modulators of noise and differentiation in embryonic stem cells

Abstract

During embryonic development, many cell types arise from a single homogenous cell population. Coordination via cell-cell signaling leads to functional specialization by changing the set of expressed genes. In very early mammalian development, the homogenous cell population of pluripotent cells in the inner cell mass breaks symmetry and differentiates into epiblast and primitive endoderm lineages under the influence of Fibroblast Growth Factor (FGF), Wingless Integrated (Wnt), and mammalian Target Of Rapamycin (mTOR) signaling. These signals modulate the activity of sequence-specific and general transcription factors. The involved sequence-specific transcription factors have not been identified for all mentioned signals and it is unclear whether there are specific components of the general transcriptional machinery which are especially important during early differentiation. Moreover, it is an open question how signals and general transcription factors cooperate to shape the transcriptional dynamics. Here, I ask how developmental signals are translated into transcriptional responses in pluripotent mouse embryonic stem cells (mESCs). I show that FGF4 signaling affects the transcriptional dynamics at target genes, resulting in an increase in cellular noise. I perform a genome-wide CRISPR screen to identify further signaling components and general transcriptional regulators for gene expression changes upon differentiation signals. Specifically, I focus on gene perturbations affecting the expression of a Spry4H2B-Venus reporter, which is upregulated in response to FGF signaling during the transition from naïve pluripotency to both epiblast and primitive endoderm cells. This screen returns multiple hits related to FGF signaling as expected and reveals general transcription factors associated with the Elongator and Mediator complexes. Focusing on Med12, a Mediator subunit whose loss affects the expression of the Spry4 reporter strongest, I find that it regulates gene expression during pluripotency transitions acting in parallel to FGF, Wnt, and mTOR signaling. During the exit of pluripotency, Med12-mutant cells react less efficiently to changes in the signaling environment both functionally and on the gene expression level. Surprisingly, the generation of epiblast and primitive endoderm cells is largely buffered against the loss of Med12. During this bifurcation, Med12-mutant cells show lower plasticity and noise levels, causing a better separation between the two cell types. These findings suggest that Med12 is an important general transcription factor during differentiation to prime transcriptional changes. Med12 acts in parallel to FGF-signaling in order to regulate the transcriptional variability and thereby allows cells to explore differentiation trajectories while keeping their plasticity.

Während der Embryonalentwicklung entstehen verschiedene Zelltypen aus einer einzigen homogenen Zellpopulation. Welche Gene für die funktionale Spezialisierung exprimiert werden, wird durch Zell-Zell Kommunikation koordiniert. In sehr frühen Stadien der Embryonalentwicklung von Säugetieren tragen die Signalmoleküle FGF (Fibroblast Growth Factor), Wnt (Wingless Integrated) und mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) dazu bei, Zellen der inneren Zellmasse zu entweder Epiblast- oder primitiven Endodermzellen zu differenzieren. Diese Signale beeinflussen die Aktivität von sequenz-spezifischen und generellen Transkriptionsfaktoren. Nicht für alle involvierten Signale wurden bereits sequenz-spezifische Faktoren identifiziert. Zudem ist unbekannt welche generellen Komponenten der Transkriptionsmaschinerie besonders wichtig während der frühen Zelldifferenzierung sind und wie diese mit den Signalen kooperieren um die Dynamik der Transkription zu regulieren. In dieser Arbeit erforsche ich anhand von embryonalen Mäusestammzellen wie die Signale während der Embryonalentwicklung in transkriptionelle Antworten übersetzt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass FGF4 die Dynamik der Transkription so reguliert, dass die Zielgene eine besonders hohe Variabilität aufweisen. Durch ein genomweites CRISPR Mutantenscreening identifiziere ich verschiedene Signalwege und allgemeine transkriptionelle Regulatoren, die die Genexpression verändern. Speziell konzentriere ich mich auf Mutationen, die ein fluoreszentes Spry4-Reportergen regulieren, das während des Übergangs von naiver Pluripotenz zu Epiblast- und primitiven Endodermzellen exprimiert wird. Dieses Screening bestätigt den Zusammenhang mit dem FGF-Signalweg und offenbart allgemeine Transkriptionsfaktoren, die mit den Elongator- und Mediator-Komplexen assoziiert sind. Den größten Effekt auf die Expression des Spry4-Reportergens hat der Verlust von Med12. Diese Untereinheit des Mediator-Komplexes beeinflusst die Genexpression beim Übergang zwischen verschiedenen Pluripotenzstadien parallel zu FGF-, Wnt- und mTOR-Signalen. Med12-mutante Stammzellen reagieren sowohl funktionell als auch auf der Ebene der Genexpression weniger effizient auf Veränderungen in der Signalumgebung. Überraschenderweise bleibt die Generierung von Epiblast- und primitiven Endodermzellen weitgehend unverändert zwischen Wildtyp und Med12-mutanten Zellen. Während dieser Verzweigung zeigen Med12-mutierte Zellen niedrigere Plastizitäts- und Variabilitätsniveaus, was zu einer besseren Trennung zwischen den beiden Zelltypen führt. Die Ergebnisse legen nahe, dass Med12 ein wichtiger genereller Transkriptionsfaktor während der Zelldifferenzierung ist um transkriptionelle Veränderungen zu initiieren. Zusammen mit dem parallel agierendem FGF-signal ermöglicht Med12 Zellen die Variabilität der Transkription zu regulieren, sodass diese verschiedene Differenzierungspfade erkunden können während ihre Stammzellplastizität aufrechterhalten wird.