Strukturbasierte Entwicklung von Assaysystemen und Charakterisierung von orthosterischen und allosterischen Kinaseinhibitoren
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2010-09-29
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Die Proteinkinasen stellen eine wichtige Enzymklasse für die Regulation der Signaltransduktion
dar. Sie steuern diese diffizil regulierten, intrazellulären Signalkaskaden durch Übertragung der
?-Phosphatgruppe von ATP auf andere Proteine. Fehlregulationen dieser komplexen
Stoffwechselwege können Krankheiten wie Krebs, Diabetes oder Autoimunkrankheiten
verursachen. Somit gehören die Kinasen in den letzten Jahren zu den wichtigsten Zielproteinen
der Pharmaindustrie.
Die klassischen Kinaseinhibitoren binden an die ATP-Bindungstasche. Zwar können diese hoch
affin an die entsprechenden Kinasen binden, jedoch fällt die Selektivität dieser Inhibitoren
gegenüber anderen Vertretern der Kinasefamilie oft sehr gering aus. Außerdem treten bei den
Kinaseinhibitoren, die als Medikamente in der Langzeitbehandlung von Tumoren Anwendung
finden, häufig Wirkstoffresistenzen auf. Diese resultieren häufig auf Grund von Mutationen in
der ATP-Bindungstasche, sodass die Bindungen zwischen Ligand und Protein geschwächt
werden und der Inhibitor somit weniger potent ist. Zur Umgehung dieser Problematiken wird
verstärkt nach neuen Substanzklassen mit alternativen Bindungsmodi gesucht. Darunter fallen
irreversible Inhibitoren, Stabilisatoren der inaktiven Kinasekonformation sowie allosterische
Kinaseinhibitoren. Die spezifische Identifizierung und Charakterisierung dieser speziellen
Inhibitionstypen mit herkömmlichen Assaysystemen ist sehr aufwendig ist und erlaubt keine
Durschmusterung größerer Substanzbibliotheken. Das Ziel dieser Arbeit war, für die drei
verschiedenen Bindungsmechanismen Assaysysteme zu entwickeln, die eine direkte
Identifizierung unterschiedlicher Inhibitionstypen zulassen. Hierfür wurden zunächst die zu
adressierenden Kinasen cSrc, Abl und p38a rekombinant in E. coli exprimiert und anschließend
aufgereinigt. Zur Detektion dienten verschiedene organische Moleküle als Sonden, die an die zu
adressierende Bindungstasche binden. Hierbei wurde von unterschiedlichen Messprinzipien wie
Fluoreszenz, Chemilumineszenz und Fluoreszenzpolarisation Gebrauch gemacht. Zur möglichen
HTS-Anwendung wurden die Assaysysteme in 384er Mikrotiterplatten etabliert und mit bekannten Inhibitoren validiert. Die Bindung relevanter Liganden wurde zur Ableitung von
Strukturaktivitätsbeziehungen röntgenkristallographisch untersucht.
1. Einfluss von irreversiblen Inhibitoren auf wirkstoffresistente Kinasemutanten
Irreversible Inhibitoren folgen durch graduelle Elimination des Anteils an enzymatisch aktivem
Enzym einer zeitabhängigen Kinetik. Somit ist die IC50-Bestimmung besonders bei hoch
potenten Inhibitoren kein geeignetes Maß zur Charakterisierung der Inhibitionsstärke. Deshalb
wurde ein Assaysystem entwickelt, dass auf Eigenfluoreszenz irreversibler Inhibitoren beruht.
Bei Ausbildung der kovalenten Bindung einer elektrophilen Gruppe mit der Seitenkette eines
spezifischen Cysteins in der ATP-Bindungstasche kommt es zur Änderung der intrinsischen
Fluoreszenz des Inhibitormoleküls. Dieses diente als Detektionssystem und ermöglichte eine
Klassifizierung irreversibler Verbindungen anhand ihrer Reaktivität durch die Detektion der
Komplexbildungsgeschwindigkeit. Zusätzlich konnte hiermit der Einfluss einer zur
Wirkstoffresistenz führenden Mutation in der ATP-Bindungstasche untersucht werden. Es
konnte unabhängig von katalytischer Aktivität gezeigt werden, dass die raumeinnehmende
Aminosäure die Geschwindigkeit der Komplexbildung von Inhibitor und Enzym herabsetzt, was
auf eine sterische Interferenz zurückzuführen ist.
2. Detektion von Stabilisatoren der inaktiven Kinasekonformation
Viele Kinasen liegen im inaktiven Zustand in einer speziellen Konformation vor die von der
aktiven stark abweicht. Hierbei wird entweder die Anlagerung von ATP oder die Katalyse des
Phosphatgruppentransfers unterbunden. Strukturell gesehen öffnet sich in der inaktiven
Konformation ein hydrophober Bereich in der Nähe der ATP-Bindungstasche. Dieser ist für
Liganden zugänglich, die die inaktive Kinasekonformation stabilisieren. Solche Liganden sind
für die p38a Kinase bereits bekannt. Basierend auf dieser Information wurde eine Sonde
entwickelt, die an die inaktive Kinasekonformation der p38a Kinase bindet. Das Assaysystem
basiert auf Enzym-Fragment-Komplementation, bei der eine verkürzte und damit inaktive
Variante der ß-Galactosidase eingesetzt wird. Zusätzlich enthält die Sonde ein Peptid-Fragment der ß-Galactosidase. Wird die Sonde von ihrer Bindungstasche verdrängt, liegt diese frei im
System vor und kann einen Komplex mit der verkürzten ß-Galactosidase eingehen. Diese wird
dadurch enzymatisch aktiv, was mit Chemilumineszenz nachgewiesen werden kann. Das System
wurde zum Test einer Reihe von Inhibitoren mit unterschiedlichen Bindungsmechanismen
verwendet. Für schwache Liganden der inaktiven Konformation eignet sich dieser Assay
besonders gut, da bei vielen anderen Assaysystemen die Kinase in der aktiven Konformation
vorliegt und diese Liganden somit übersehen werden können. Es konnte gezeigt werden, dass der
Ligand der Sonde auch an weitere Kinasen bindet. Daraufhin wurde dieses Assaysystem für
insgesamt fünf verschiedene Kinasen aufgebaut.
3. Assaysystem zur Detektion von allosterischen Inhibitoren der Abl-Kinase
Die Abl-Kinase verfügt über einen Autoinhibitionsmechanismus, bei der die inaktive
Kinasekonformation durch SH2- und SH3-Domänen sowie durch eine myristoylierte Region, die
an die sogenannte Myristoylierungstasche bindet, stabilisiert wird. Adrian et al. haben gezeigt,
dass auch kleine organische Moleküle an diese Region binden können und die Aktivität der
Kinase herabsetzen. Um tiefere Einblicke in diese Regulationsform und deren Liganden zu
erhalten, wurde ein Assaysystem zur Detektion von Liganden der Myristoylbindungstasche
aufgebaut. Der auf Verdrängung einer Sonde beruhende Assay basiert auf
Fluoreszenzpolarisation. Hierfür wurde eine Sonde generiert, die aus einem Liganden der
Myristoylierungstasche sowie dem Fluorophor Fluoreszein besteht. Bei Verdrängung der Sonde
durch weitere Liganden liegt diese frei in Lösung vor wodurch sich die Fluoreszenzpolarisation
ändert. Dies dient als Maß für die Verdrängung der Sonde durch eine getestete Substanz. Da
dieser Assay mit nur wenigen Pipettierschritten durchgeführt werden kann, konnten sehr einfach
viele Moleküle in kurzer Zeit getestet werden. Die Ergebnisse waren äußerst robust und
reproduzierbar.
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Keywords
strukturbasiertes Wirkstoffdesign, Kinaseinhibitoren