Lehrstuhl für Bioorganische Chemie

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http://hdl.handle.net/2003/26428

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Mikrobielle Biosynthese
(2015) Arens, Julia; Schulz, Frank; Brakmann, Susanne
Diese Arbeit beschäftigt sich anhand ausgewählter Beispiele aus den zwei großen Naturstoffklassen der Terpene und Polyketide mit unterschiedlichen (chemo-)fermentativen und (chemo-)enzymatischen Verfahren, um die Verfügbarkeit von Naturstoffen zu verbessern oder deren Derivatsierbarkeit zu ermöglichen. Zur Verbesserung der Verfügbarkeit der Naturstofffamilie der Diterpenfusicoccane wurde die präparative, heterologe Fermentation des biosynthetischen Intermediats Fusicocca-2,10(14)-dien in einem durch Metabolic Engineering optimierten Bäckerhefestamm etabliert. Dabei wurde die Ausbeute durch eine systematische Variation der Fermentationsparameter von anfänglich 6 mg/L auf 30 mg/L gesteigert. Neben der Optimierung äußerer Parameter, wurde sich auch mit der Identifizierung inhärenter, limitierender Schritte beschäftigt. Eine Analyse der unabhängigen Expression der beiden Domänen des bifunktionellen Schlüsselenzyms bei der Biosynthese des Fusicocca-2,10(14)-diens wies darauf hin, dass die lösliche Expression des Gesamtproteins durch die schlechte lösliche Expression der N-terminalen Terpencyclasedomäne limitiert sein könnte. Um die intrinsische Stabilität dieses Enzyms oder der Cyclasedomäne zu erhöhen, wurde ein Verfahren für die gerichtete Proteinevolution diese Enzyms und einzelner Domänen entwickelt. In einer ersten Generation wurden bereits Hot Spots für die Erzeugung löslicherer Enzymvarianten identifiziert. Zur Erzeugung einfacher Diterpenfusiocaccananaloga, um die phytotoxischen und anticarcinogenen Wirkungen dieser Substanzfamilie nachzuahmen, wurde die enzymatische, oxidative Derivatisierung des Fusicocca-2,10(14)-diens in vitro anvisiert. Alternativ zu der Ganzzellfermentation wurde auch ein Konzept zur in vitro Totalsynthese von Terpenen mittels thermostabiler Enzyme vorgestellt. Außerdem wurde sich mit der Substraterkennung in der Polyketidbiosynthese beschäftigt. Durch gezielte Mutagenese und Fütterung unnatürlicher Substratderivate konnten zwei neue Erythromycinderivate erzeugt sowie die Einbaurate der artifiziellen Bausteine verbessert werden. Alternativ konnten durch die Ausnutzung der natürlichen Substrattoleranz der Polyketidsynthase in der Monensinbiosynthese durch die Fütterung artifizieller Bausteine drei neue Monensinderivate massenspektrometrisch nachgewiesen werden.
Development of a conformation sensitive assay for the detection of inter-domain interactions mediated by allosteric akt inhibitors
(2013-08-28) Fang, Zhizhou; Rauh, Daniel; Waldmann, Herbert
Die Aktivität vieler Proteinkinasen wird durch das Zusammenspiel der Kinasedomäne mit zusätzlichen regulatorischen Domänen gesteuert. Daher besitzen niedermolekulare Verbindungen, die solche Interdomänen-Interaktionen allosterisch adressieren und modulieren können, einen großen Wert in der chemischen Biologie und der Pharmaforschung, da diese Interaktionen oft spezifisch für bestimmte Kinasen bzw. Kinasefamilien sind, und somit im Gegensatz zu klassischen ATP-kompetitiven Inhibitoren eine höhere Selektivität versprechen. Die Proteinkinase B (PKB, auch genannt Akt) ist eine solche Multidomänen-Kinase und stellt ein wichtiges Zielprotein in der Krebsforschung dar. Im Hochdurchsatzscreening wurden in den letzten Jahren eine neue Familie von allosterischen Akt Inhibitoren entdeckt, deren Wirkmechanismus die Anwesenheit einer regulatorischen PH Domäne voraussetzt, da sie in einer Bindungstasche an der Grenzfläche zwischen der Kinase- und PH Domäne binden und dadurch Akt in einer inaktiven Konformation arretieren. Diese einzigartige Bindetasche führt zu einer außergewöhnlich hohen Selektivität und somit in vivo potenziell niedrigen Toxizität durch Reduktion unerwünschter Arzneimittelwirkungen. Allerdings basieren alle bisher bekannten Interdomänen-Inhibitoren auf demselben chemischen Grundgerüst, und die Identifizierung von neuartigen Leitstrukturen wird durch den Mangel an geeigneten Hochdurchsatzmethoden ausgebremst. In der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung von iFLiK (interface-FLiK) beschrieben, einem Fluoreszenz-basierten Assay, der solche Interdomänen-Interaktionen detektieren kann. Die für iFLiK benötigten Proteine wurden anhand kristallographischer Informationen konzipiert, in Insektenzellen exprimiert und schließlich mit verschiedenen Fluorophoren gekuppelt, um ihre Eignung als Sensoren für Proteinkonformationen sys-tematisch zu untersuchen. Zur Etablierung des Assays wurden zudem eine Reihe von Sondenmolekülen synthetisiert und auf ihre biologische Aktivität in vitro und in BT474 Zellen untersucht. Mit iFLiK konnten allosterische Inhibitoren von ATP-kompetitiven unterschieden und somit ein Machbarkeitsbeweis erbracht werden, dass solvatochrome Fluorophore zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen geeignet sind, wenn der Fluorophor an der korrekten Stelle angebracht ist. Nach sorgsamer und eingehender Assayoptimierung sowie Validierung mit orthogonalen Assaysystemen wurde eine interne Substanzbibliothek mit iFLiK durchmustert. Dadurch konnten Verbindungen mit einem neuartigen Grundgerüst gefunden werden, die vorher nicht als allosterische Akt Inhibitoren bekannt waren.
Chemoinformatische Entwicklung von Naturstofffragmenten, sowie deren strukturbiologische und biochemische Evaluierung zur fragmentbasierten Inhibitorentwicklung
(2013-01-23) Over, Björn; Waldmann, Herbert; Rauh, Daniel
Die Fragmentbasierte Wirkstoffentwicklung (FBDD) hat sich als wertvolle Methode zur Detektion neuer Moleküle mit inhibitorischen Eigenschaften etabliert. Allerdings bestehen die derzeit üblicherweise verwendeten Fragment-Bibliotheken aus sp2-reichen Molekülen und es werden daher verstärkt Wege gesucht den erforschbaren chemischen Strukturraum zu erweitern.1-4 Biologisch validierte Naturstoffe sind reich an Stereozentren und decken einen Bereich des chemischen Strukturraums ab, der von im Allgemeinen genutzten synthetischen Molekülen nicht abgebildet wird.5 Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich ein Algorithmus entwickelt, der in der Lage ist Naturstoffe zu Naturstofffragmeten zu reduzieren und dabei die wichtigen funktionellen Gruppen, sowie Anknüpf- bzw. Modifikationspunkte an ihrer natürlichen Position zu erhalten. Es wurde ein Datensatz mit über 180,000 annotierten Naturstoffen analysiert und eine repräsentative Bibliothek aus 2,000 von Naturstoffen abgeleiteten Fragmenten zusammengestellt, die die Eigenschaften aller generierten ~110,000 Naturstofffragmente und der ursprünglichen Naturstoffe widerspiegeln und reich sind an sp3-konfigurierten Stereozentren. Diese Strukturen unterscheiden sich erwartungsgemäß vom bisher untersuchbaren chemischen Strukturraum. Dennoch sind für ungefähr die Hälfte der virtuellen Bibliothek repräsentative Fragmente kommerziell verfügbar. Mit Hilfe dieser Naturstofffragmente konnten, auch bei etablierten Zielproteinen, bisher unbekannte inhibitorische Fragmente gefunden werden. Unter anderem wurde das Konzept durch die Identifizierung von neuen Inhibitoren der aktiven Form und neuartigen Stabilisatoren der inaktiven Form von p38a MAP Kinase validiert. Zudem konnten insgesamt 52 Fragmente als neuartige Phosphataseinhibitoren gefunden werden.
Design, synthesis and applications of an imidazole phosphonate based mimic of 3-phosphohistidine
(2012-12-21) Vliet, Bart van; Waldmann, Herbert; Christmann, Mathias
Reduzierte Polyketide
(2012-10-16) Sundermann, Uschi; Schulz, Frank; Waldmann, Herbert
Polyketide sind eine strukturell heterogene Gruppe von Naturstoffen mit oftmals faszinierenden Bioaktivitäten die therapeutisch genutzt werden können. Die für den Einsatz in der Medizin meist notwendige Derivatisierung dieser Substanzen stellt große Herausforderungen an die modernen chemischen Wissenschaften. Der Schwerpunkt dieser Dissertation liegt auf der Erforschung und Manipluation der Substratspezifität von Typ-I-Polyketidsynthasen, den zentralen und sehr komplexen Enzymen aus der Polyketid-Biosynthese. Neben klassischen Ansatzpunkten konnte die zielgerichtete Mutation von Acyltransferasen sowie der reduktiven Domänen etabliert werden. Hierdurch gelang es, sowohl neue Erkenntnisse über die Substratspezifität der Polyketidsynthasen zu gewinnen als auch neue antibiotisch wirksame Polyketid-Derivate zu erzeugen.
Design, synthesis and evaluation of natural product based compound collections
(2012-04-11) Zimmermann, Tobias J.; Waldmann, Herbert; Otterlo, Willem van
Entwicklung von Anellierungsreaktionen zur Synthese Naturstoff-inspirierter Gerüststrukturen
(2012-04-02) Wittstein, Kathrin; Waldmann, Herbert; Krause, Norbert
Cascade/domino synthesis strategy to enrich small molecule collections with skeletal diversity and molecular complexity
(2011-11-14) Liu, Wei; Waldmann, Herbert; Schulz, Frank
Design, synthesis and application of small molecule acyl protein thioesterase inhibitors
(2011-10-27) Rusch, Marion; Waldmann, Herbert; Goody, Roger S.
Studien zur Totalsynthese von Prieurianin und Synthese des B-seco Limonoid Grundgerüsts
(2011-10-20) Schuster, Hannah; Waldmann, Herbert; Schulz, Frank
Grundlage des ersten Teils der Arbeit ist die präzedenzlose biologische Aktivität des Terpens Prieurianin. Es wird angenommen, dass Prieurianin als bisher einziger bekannter Naturstoff die zelluläre Aktinpolymerisation durch Wechselwirkung mit einem Aktin-bindenden Protein beeinflusst, ohne direkt an Aktin zu binden. Der Naturstoff ist damit ein potentielles Krebs- Cytostatikum mit bisher einzigartiger Wirkungsweise. Dementsprechend stellt Prieurianin mit dieser interessanten biologischen Aktivität und der komplexen chemischen ein attraktives und anspruchsvolles Syntheseziel dar. Im Rahmen der Dissertation wurden Studien zur Totalsynthese des Naturstoffs Prieurianin durchgeführt sowie ein synthetischer Zugang zum prävalidierten B-seco Limonoid Grundgerüst entwickelt. Eine IRELAND-CLAISEN-Umlagerung stellt dabei den Schlüsselschritt der Synthesestrategie dar. Im zweiten Teil der Dissertation wurde entsprechend des BIOS-Konzepts (BIOS: Biologieorientierte Synthese) ein effizienter synthetischer Zugang zu stereochemisch komplexen Spirotryprostatin A Analoga entwickelt. Das pentacyclische Gerüst wurde ausgehend von einfachen Startmaterialien in einer Eintopfsynthese aufgebaut, welche eine katalytische, enantioselektive [3+2]-Cycloaddition als Schlüsselschritt beinhaltet.
Quantitative Analyse des Survival of Motor Neuron(SMN)-Komplexes unter Verwendung von absoluter Quantifizierung SMN-Komplex-spezifischer Peptide durch synthetische stabilisotopenmarkierte Peptidanaloga
(2011-10-17) Wiesner, Julia; Sickmann, Albert; Spiteller, Michael
Der SMN-Komplex ist eine makromolekulare Einheit, die aus neun festen Untereinheiten (SMN, Gemin2-Gemin8, Unrip) und verschiedenen transienten Faktoren (SmB/B’, SmE, SmF, SmG, SmD1-D3) aufgebaut ist. Die Hauptaufgabe des ubiquitären Komplexes umfasst die Assemblierung der U snRNPs im Cytoplasma und ihre Translokation in den Zellkern, wo sie am Aufbau des Spleißosoms beteiligt sind. Durch Mutation oder Deletion des SMN1-Gens kann dieser Prozess gestört sein und dadurch Spinale Muskelatrophie (SMA) auslösen. SMA ist die zweithäufigste autosomal rezessiv vererbbare Krankheit mit Todesfolge nach Mukoviszidose, die zu einer Degeneration der -Motorneuronen des Rückenmarks und damit zu einer Schwächung und einem Abbau der Muskulatur führt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung des humanen Survival of Motor Neuron-Komplex (SMN) hinsichtlich Zusammensetzung und Stöchiometrie mittels Anwendung von massenspektrometrischen Methoden. In diesem Zusammenhang wurde die native stöchiometrische Zusammensetzung des zentralen SMN-Komplexes mit zwei rekombinanten Komplexen verglichen, die beide eine in Verbindung mit SMA bekannte Mutation (Y272C, E134K) integriert hatten. Zu diesem Zweck wurden Wildtyp-SMN und die mutierten SMN-Analoga als GST-Fusions-Proteine zusammen mit Wildtyp-Gemin2, -Gemin6, -Gemin7 und -Gemin8 in Escherichia coli exprimiert. Nach Ernte und Lyse der Zellen wurde SMN auf einer Glutathion- Sepharose-Matrix angereichert und anschließend mittels verschiedener Methoden (Carbamidomethylierung, Trypsin-Verdau) für die massenspektrometrische quantitative Analyse vorbereitet. Des Weiteren wurden die Unterschiede zwischen dem cytoplasmatischen und dem nukleären SMN-Komplex, welche durch Zellkern-Cytoplasma-Trennung von HeLa-Zellen mittels eines modifizierten Roeder-Protokolls und anschließende Co-Immunopräzipitation gegen den SMNspezifischen Antikörper 7B10 erhalten wurden, untersucht. Für die Quantifizierung der SMN-Komplexe wurde Absolute Quantifizierung (AQUA) angewendet. Synthetische stabilisotopenmarkierte Petidanaloga wurden mit den nativen Proben in definierten Konzentrationen verdünnt und konnten während der massenspektrometrischen Analyse durch ihre Massendifferenz von 6 bis 10 Dalton im Vergleich zu den endogenen Peptiden detektiert werden. Zuvor mussten jedoch geeignete Peptidsequenzen ausgewählt werden, um eine reproduzierbare Quantifizierung zu gewährleisten. Dazu mussten die Peptide definierten Spezifikationen entsprechen (z.B. keine leicht modifizierbaren Aminosäuren oder keine überlesenen tryptischen Schnittstellen beinhalten). Die MS-Analyse wurde mittels Selected Reaction Monitoring (S/MRM) auf zwei unterschiedlichen Triple-Quadrupol-Systemen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die Übergänge und Systemparameter (Declustering Potential und Kollisionsenergie) für jedes einzelne Peptid optimiert und festgelegt. Alternativ wurde markierungsfreie Quantifizierung auf einem LTQ Obitrap Velos System angewandt. Die hohe Massengenauigkeit und Sensitivität des Hybrid-FT-MS-Systems erlaubt eine Quantifizierung der entsprechenden Mutterionen direkt aus der MS1-Spur (ohne Anwendung von Tandem-MS-Experimenten). Beide Strategien, S/MRM und MS1, erlauben eine Quantifizierung von Peptiden mit Konzentrationen bis 250 amol. Durch Optimierung des dargestellten Protokolls, war es möglich den Einfluss bekannter Patientenmutationen des SMN1-Gens auf die Stöchiometrie des SMNKomplexes zu untersuchen, sowie den Unterschied zwischen SMN-Komplexen des Cytoplasmas und des Zellkerns zu bestimmen. Dieses Projekt kann dazu beitragen sowohl die Assemblierung der U snRNPs besser zu verstehen, als auch neue Zielmoleküle für Diagnose und Therapie von genetischen Krankheiten wie SMA bereitzustellen.
Strukturbasierte Entwicklung und Synthese von Enzyminhibitoren
(2011-09-22) Getlik, Matthäus; Rauh, Daniel; Waldmann, Herbert
Synthese niedermolekularer Verbindungen zur Stabilisierung von Protein-Protein-Interaktionen
(2011-09-02) Richter, Anja; Waldmann, Herbert; Rauh, Daniel
Die phytotoxische Wirkung des Naturstoffs Fusiocccin A, erstmals isoliert von Ballio et al. aus dem Pilz Fusicoccum amygadali, lässt sich auf die Stabilisierung der Interaktion zwischen einem 14-3-3-Adaptorprotein und der C-terminalen Bindedomäne der pflanzlichen Protonenpumpe zurückführen. Neben diesem interessanten Wirkmechanismus des Diterpens stellt dessen Synthese aufgrund seines hochgradig substituierten und gespannten 5-8-5-Ringerüsts eine enorme synthetische Herausforderung dar. Derzeitig finden sich in der Literatur einige Ansätze zur Darstellung solcher Ringsysteme, ein Zugang zu Fusicoccin ergibt sich hieraus jedoch nicht. Im Rahmen dieser Dissertation wird eine Samarium(II)-vermittelte Ketyl-Olefin- Kupplung als Schlüsselschritt zur Synthese von Fusicoccin diskutiert und die erfolgreichen, stereoselektiven Synthesen benötigter Fragmente werden präsentiert. Neben Fusicoccin wurden im Rahmen von Oberflächenplasmonresonanz- Untersuchungen das Dipeptid Epibestatin und Pyrrolidon 1 als Verbindungen zur Stabilisierung der oben genannten Wechselwirkung identifiziert. Vor diesem Hintergrund beschreibt die vorliegende Arbeit des Weiteren die enantioselektive Synthese der nichtnatürlichen Aminosäure α-Hydroxy-β-aminophenylbuttersäure und deren Verwendung zur Synthese von Epibestatin, -derivaten und Stereoisomeren. Um letztendlich zu Verbindungen mit verbesserten stabilisierenden Eigenschaften zu gelangen, wird zusätzlich die Synthese einer kleinen Substanzsammlung von Pyrrolidonen und Pyrazolen und deren Erprobung in Oberflächenplasmonresonanz-Messungen vorgestellt.
Biologische Charakterisierung von Indolochinolizinen
(2011-08-12) Pries, Verena; Waldmann, Herbert; Schulz, Frank
Laut einer Schätzung werden im Jahr 2020, durch Faktoren wie die Überalterung der Weltbevölkerung, die Verwestlichung der Ernährungsgewohnheiten und die zunehmende Umweltverschmutzung, 15 Millionen neue Krebsfälle diagnostiziert und 12 Millionen Menschen werden auf Grund einer Krebserkrankung sterben (Bray & Moller, 2006). Dies verdeutlicht die Wichtigkeit, neue Wirkstoffe zu entwickeln, die in der Lage sind Krebserkrankungen aufzuhalten oder besser noch zu heilen. Ein beliebter Ansatzpunkt für Therapeutika ist der Zellzyklus, um die Hyperproliferation von Tumorzellen zu stoppen und die Zellen nachfolgend in die Apoptose zu leiten. Viele in der Klinik erfolgreich eingesetzte Chemotherapeutika verändern die Tubulin- Dynamik und inhibieren somit den mitotischen Spindelapparat, was zu einer Arretierung der Mitose und dem anschließenden Absterben der Tumorzellen führt. Aufgrund der Tatsache, dass dynamische Mikrotubuli auch wichtige Funktionen in nicht proliferierenden Zellen erfüllen, führt der Einsatz von Tubulin-bindenden Wirkstoffen zu zahlreichen Nebenwirkungen. Deshalb ist es von großer Bedeutung niedermolekulare Substanzen zu identifizieren, welche geeignet sind, andere wesentliche Proteine des Zellzyklus zu modifizieren und dadurch den Tod der Tumorzellen herbeizuführen. Bereits im Vorfeld wurden in einem zellulären Testsystem Substanzen aus einer abteilungseigenen Indolochinolizin-Bibliothek identifiziert, welche in der Lage waren den Zellzyklus zu inhibieren. Der durch diese Substanzen induzierte Phänotyp konnte durch die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen, wie Lebendzell-Mikroskopie, Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie, näher beschrieben werden. So führte die Inkubation von HeLa-Zellen mit den Indolochinolizinen zu fehlorientierten Chromosomen während der Metaphase und dem Auftreten von zusätzlichen Spindelpolen, was zu multipolaren Spindeln führte. Dieser Phänotyp ließ vermuten, dass die Zellen nicht mehr in der Lage sind ihre Centrosomen zu „zählen“, weshalb die aktiven Substanzen als Centrocountine bezeichnet wurden. Außerdem konnten Immunfluoreszenz-Aufnahmen einer BUB1-Färbung eine Aktivierung des Spindel- Kontrollpunktes zeigen. Die Analyse des Interkinetochor-Abstandes wies darauf hin, dass die Aktvierung des Kontrollpunktes durch eine fehlende Spannung zwischen den Kinetochoren und den Mikrotubuli ausgelöst wurde. Die Spindel-Kontrollpunkt-Aktivierung resultierte in einem mitotischen Arrest, welcher durch die etwa fünfmal so lange Mitose-Dauer von mit Centrocountin 1 behandelten Zellen im Gegensatz zu den Kontrollzellen gezeigt werden konnte. Auch die Zellzyklus-Analyse zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg der mitotischen Zellen. Ferner war ein Rückgang der HeLa-Zellproliferation auf etwa 60% zu verzeichnen. Dieser war zum einen durch das Anhalten des Zellzyklus in der M-Phase, zum anderen durch das Einsetzen der Apoptose zu erklären. Durch Immunfluoreszenz-Aufnahmen in acht weiteren Zelllinien konnte gezeigt werden, dass das Auftreten der fehlorientierten Chromosomen sowie der zusätzlichen Spindelpole zelltypübergreifend ist. Aufgrund des interessanten Phänotyps war es im weiteren Verlauf von besonderer Bedeutung die Zielproteine der Centrocountine zu identifzieren. So wurde zunächst versucht eine Zielprotein-Identifizierung mittels wissenschaftlicher Hypothesen durchzuführen. Zu den potentiellen Zielproteinen zählten Tubulin, zahlreiche Zellzyklus-spezifische Kinasen und die Phosphatase CDC25a, welche jedoch alle mit Hilfe entsprechender in vitro oder in vivo Testsysteme ausgeschlossen werden konnten. Basierend auf den oben beschriebenen phänotypischen Analysen konnte eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung aufgestellt werden, welche die Synthese einer Sonde für die Affinitätschromatographie ermöglichte. Die hergestellte Sonde wurde über ein freies Amin an eine NHS-aktivierte Sepharose gekoppelt, so dass eine Affinitätsreinigung mit HeLa-Zelllysaten durchgeführt werden konnte. Mit Hilfe einer Kombination aus der vergleichenden und kompetitiven Variante der Affinitätschromatographie konnte das nukleolare Protein Nucleophosmin (NPM) als Zielprotein identifiziert werden. Die anschließende Literaturrecherche ergab, dass das Ausschalten von NPM durch RNAi ähnliche Effekte, wie die durch Centrocountin ausgelösten, verursachte. Auch eine Störung der Bindung des nuklearen Export-Rezeptors CRM1 an NPM führte zu dem beobachteten Phänotyp. So wurden für folgende Validierungs-Experimente sowohl NPM als auch der NPM-CRM1-Komplex als mögliche Bindungspartner in Betracht gezogen. Sowohl NPM als auch CRM1 konnten mittels Immundetektion nach erfolgter Affinitätschromatographie nachgewiesen werden. Ebenso war eine konzentrationsabhängige Verdrängung mit einem Überschuss an Centrocountin 1 zu verzeichnen. Ferner konnte durch Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie und Fluoreszenz- Polarisation in vivo und in vitro eine Bindung beider Proteine an ein mit Cy3 modifiziertes Centrocountin gezeigt werden. Aufgrund der diversen Aufgaben von NPM in der Zelle könnten neben der NPM-CRM1 Interaktion, auch weitere Protein-Protein-Interaktionen gestört werden, welche die beschriebenen Phänotypveränderungen hervorrufen würden. Dementsprechend könnten eine gehinderte Interaktion von NPM und PCNA während der DNA-Reparatur, von NPM und p14ARF sowie von NPM und RB zu einer Aktivierung von p53 und dem nachgeschaltetem p21WAF1/CIP1 führen. Dies würde einen Zellzyklus-Arrest auslösen, welcher oftmals in Verbindung mit der Apoptose steht. Einen Hinweis auf diesen möglichen Wirkmechanismus gaben die erhöhten Protein-Niveaus von p53 und p21WAF1/CIP1, welche in mit Centrocountin behandelten MCF7- und HCT-116-Zellen nachgewiesen werden konnten. Gehemmte Interaktionen zwischen NPM und ROCK2, NPM und BRCA2 und natürlich NPM und CRM1 könnten außerdem zu einer Centrosomen-Fragmentierung bzw. Überduplikation führen, welches ebenfalls ein Anhalten des Zellzyklus oder die Aptoptose zur Folge hätte. Aufgrund der Tatsache, dass NPM proto-onkogene Funktionen ausübt und das am häufigsten mutierte Gen in hämatopoetischen Tumoren ist, ist die Entdeckung von Centrocountin, einem neuen NPM-Inhibitor, von besonderer Bedeutung. Auch Centrocountin als biologisches Werkzeug nutzen zu können, um die zahlreichen zellulären Funktionen von NPM besser zu untersuchen und zu verstehen, kann nicht außer Acht gelassen werden.
Synthese und biologische Evaluierung von N-Ras-Proteinen mit nicht-natürlichem C-Terminus
(2011-07-21) Görmer, Kristina; Waldmann, Herbert; Christmann, Mathias
Identification, synthesis & design of selective RabGGTase inhibitors
(2011-06-29) Stigter, Elisabeth Anouk; Waldmann, Herbert; Goody, Roger S.
Identifikation Mitose- und Zytoskelett-modulierender Substanzen mittels vorwärts gerichteter chemischer Genetik
(2011-04-28) Gerding-Reimers, Claas; Waldmann, Herbert; Goody, Roger S.
Der Zellzyklus sowie die Mitose werden durch ein komplexes Netzwerk von Proteinen reguliert und angetrieben. Fehler in diesen Prozessen können zu einer deregulierten Proliferation und folglich zur Entstehung von Krebszellen führen. Bestandteile des Zytoskeletts sind nicht nur von entscheidender Bedeutung während der Mitose sondern auch in nachfolgenden Prozessen der Krebsentstehung. Chemische Substanzen, die modulierend auf den Zellzyklus, die Mitose und Bestandteile des Zytoskelettes wirken können, sind daher von großem Interesse in der Krebstheraphie. Ein Ziel dieser Arbeit war die Validierung und Bewertung in der Abteilung vorhandener High Content Screens zur Identifikation solcher Substanzen innerhalb Naturstoff-basierter Substanzbibliotheken. Daher wurde in einem Pilotprojekt ein paralleler Screen von 1500 Naturstoffen mittels des MDCK-F3- und des BSC-1 Phänotyp-Screens durchgeführt. Die Identifikation mehrerer bekannter Naturstoffe mit antimitotischer und Zytoskelettmodulierender Wirkung zeigte hierbei eine besondere Eignung des BSC-1 Phänotyp- Screens. Ein weiteres Ziel war die nähere Charakterisierung der biologischen Wirkung von, durch das High Content Screening identifizierten Substanzen. Mit Podoverin A, Maistemonin und Coreanosid F1 konnten mittels des BSC-1 Phänotyp-Screens innerhalb der Naturstoff- Substanzbibliothek unbeschriebene Bioaktivitäten dieser Substanzen erkannt werden. Nachfolgend konnte Podoverin A als antimitotische Substanz mit inhibitorischer Wirkung auf die zelluläre MT-Dynamik charakterisiert werden. Die Naturstoffe Maistemonin und Coreanosid F1 hingegen führten zu Modulationen der zellulären Aktinfilament-Organisation. Maistemonin, Coreanosid F1 und Podoverin A stellen daher interessante Leitstrukturen für die Synthese Naturstoff-basierter Substanzbibliotheken dar. Mittels des BSC-1 Phänotyp-Screens wurde daraufhin eine von Dr. Andrey Antonchick synthetisierte Naturstoff-basierte Substanzbibliothek aus 39 Spirooxindolen getestet. Die potentiell antimitotische Wirkung der hierdurch identifizierten Substanz (-)-6k konnte im weiteren Verlauf bestätigt werden. Neben einer Induktion von G2/M-Zellzyklusarrest führte die Substanz zu einer Inhibition der zellulären MT-Dynamik, wobei insbesondere eine Modulation der räumlichen Organisation des MT-Zytoskelettes auffallend war. Hierbei waren multiple MTOCs in BSC-1 Zellen und analog hierzu eine multipolare Mitose in HeLa-L Zellen erkennbar. Trotz der bekannten, inhibitorischen Wirkung des Spirooxindols Spirotrypostatin auf die αβ-Tubulin-Dynamik war die Wirkung von (-)-6k andersartig. Anhand eines etablierten ELISA Assays konnte außerdem eine für gewisse Spirooxindole typische, inhibitorische Wirkung der Substanz auf die p53/MDM2 Proteininteraktion ausgeschlossen werde. Somit gilt für die Substanz (-)-6k ein vorher unbeschriebenes Wirkprinzip der Spirooxindole als sehr wahrscheinlich. Die Identifikation des Zielproteins bietet einen interessanten Einstieg für weitere Untersuchungen zu dem Wirkstoff (-)-6k. Mittels des High Content Screenings einer, aus 150 THPs bestehenden Substanzbibliothek wurden Tubulexin A, B und C als antimitotische Substanzen identifiziert. Die zelluläre Untersuchung dieser Substanzen zeigte eine Induktion von G2/M-Arrest und Apoptose im niedrig mikromolaren Bereich. Außerdem inhibierten die Substanzen die MTRepolymerisation kältebehandelter BSC-1 Zellen. Die Studien zeigten somit ein gemeinsames Wirkprinzip der Tubulexine. Zur Identifikation des Zielproteins des bioaktivsten Derivates Tubulexin A wurde ein quantitativer, proteomischer Ansatz mittels SILAC basierter komparativer Affinitätschromatographie verwendet. Anhand dieses Ansatzes wurden, unter Berücksichtigung der zellulären Studien, αβ-Tubulin und CAS als potentielle Zielproteine identifiziert. Die Isolation durch die Tubulexin A Affinitätssonde konnte durch Immunodetektion bestätigt werden. Nachfolgend konnte die spezifische und physiologisch relevante Bindung von Tubulexin A an αβ Tubulin durch die inhibitorische Wirkung der Substanz auf die in vitro Tubulin-Polymerisation validiert werden. Dieses Ergebnis verdeutlichte, dass der zelluläre Effekt von Tubulexin A unabhängig von CAS erklärbar ist. Des Weiteren ist gezeigt worden, dass Tubulexin A ein potenter Ligand der Vinca Alkaloid- Bindestelle von αβ Tubulin ist: Unter den gewählten Bedingungen war dessen stöchiometrische Bindung an das Protein mit derer von Vinblastin vergleichbar. Die physiologische Wirkung von Tubulexin A betreffend ist neben einer spezifischen Bindung von αβ-Tubulin ein synergetischer Wirkmechanismus mit dem Protein CAS denkbar. Die Untersuchung eines solchen etwaigen Mechanismus bietet einen attraktiven Ausgangspunkt für weitere Studien. Aufgrund ihrer interessanten Bioaktivität, chemischen Zugänglichkeit, unverminderten Wirkung gegenüber Taxol resistente Zellen und einer möglichen synergetischen Wirkung auf αβ-Tubulin und CAS stellen die Tubulexine interessante Leitmotive für die Synthese Tubulexin-basierter Substanzbibliotheken dar. Es ist wahrscheinlich, dass hierdurch Substanzen mit größerer Potenz und erhöhter Selektivität gegenüber den Zielproteinen erhalten werden können.
Identifizierung und Validierung von Proteinkinasen aus dem phytopathogenen Pilz Ustilago maydis als Zielproteine niedermolekularer Kinaseinhibitoren
(2011-03-22) Tückmantel, Sandra; Waldmann, Herbert; Schreier, Peter H.
Entwicklung organokatalysierter Annelierungs- und Dominoreaktionen zur Synthese naturstoffinspirierter Substanzsammlungen
(2011-03-10) Dückert, Heiko; Waldmann, Herbert; Christmann, Mathias
Totalsynthese von Biphenomycin B und Konformationsanalyse von Biphenomycin-Analoga
(2010-11-19) He, Yupeng; Waldmann, Herbert; Krause, Norbert

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