Identifikation Mitose- und Zytoskelett-modulierender Substanzen mittels vorwärts gerichteter chemischer Genetik
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Date
2011-04-28
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Abstract
Der Zellzyklus sowie die Mitose werden durch ein komplexes Netzwerk von Proteinen
reguliert und angetrieben. Fehler in diesen Prozessen können zu einer deregulierten
Proliferation und folglich zur Entstehung von Krebszellen führen. Bestandteile des
Zytoskeletts sind nicht nur von entscheidender Bedeutung während der Mitose sondern auch
in nachfolgenden Prozessen der Krebsentstehung. Chemische Substanzen, die modulierend
auf den Zellzyklus, die Mitose und Bestandteile des Zytoskelettes wirken können, sind daher
von großem Interesse in der Krebstheraphie.
Ein Ziel dieser Arbeit war die Validierung und Bewertung in der Abteilung vorhandener High
Content Screens zur Identifikation solcher Substanzen innerhalb Naturstoff-basierter
Substanzbibliotheken. Daher wurde in einem Pilotprojekt ein paralleler Screen von 1500
Naturstoffen mittels des MDCK-F3- und des BSC-1 Phänotyp-Screens durchgeführt. Die
Identifikation mehrerer bekannter Naturstoffe mit antimitotischer und Zytoskelettmodulierender
Wirkung zeigte hierbei eine besondere Eignung des BSC-1 Phänotyp-
Screens.
Ein weiteres Ziel war die nähere Charakterisierung der biologischen Wirkung von, durch das
High Content Screening identifizierten Substanzen. Mit Podoverin A, Maistemonin und
Coreanosid F1 konnten mittels des BSC-1 Phänotyp-Screens innerhalb der Naturstoff-
Substanzbibliothek unbeschriebene Bioaktivitäten dieser Substanzen erkannt werden.
Nachfolgend konnte Podoverin A als antimitotische Substanz mit inhibitorischer Wirkung auf
die zelluläre MT-Dynamik charakterisiert werden. Die Naturstoffe Maistemonin und
Coreanosid F1 hingegen führten zu Modulationen der zellulären Aktinfilament-Organisation.
Maistemonin, Coreanosid F1 und Podoverin A stellen daher interessante Leitstrukturen für
die Synthese Naturstoff-basierter Substanzbibliotheken dar.
Mittels des BSC-1 Phänotyp-Screens wurde daraufhin eine von Dr. Andrey Antonchick
synthetisierte Naturstoff-basierte Substanzbibliothek aus 39 Spirooxindolen getestet. Die
potentiell antimitotische Wirkung der hierdurch identifizierten Substanz (-)-6k konnte im
weiteren Verlauf bestätigt werden. Neben einer Induktion von G2/M-Zellzyklusarrest führte
die Substanz zu einer Inhibition der zellulären MT-Dynamik, wobei insbesondere eine
Modulation der räumlichen Organisation des MT-Zytoskelettes auffallend war. Hierbei waren
multiple MTOCs in BSC-1 Zellen und analog hierzu eine multipolare Mitose in HeLa-L Zellen
erkennbar. Trotz der bekannten, inhibitorischen Wirkung des Spirooxindols Spirotrypostatin
auf die αβ-Tubulin-Dynamik war die Wirkung von (-)-6k andersartig. Anhand eines
etablierten ELISA Assays konnte außerdem eine für gewisse Spirooxindole typische,
inhibitorische Wirkung der Substanz auf die p53/MDM2 Proteininteraktion ausgeschlossen
werde. Somit gilt für die Substanz (-)-6k ein vorher unbeschriebenes Wirkprinzip der
Spirooxindole als sehr wahrscheinlich. Die Identifikation des Zielproteins bietet einen
interessanten Einstieg für weitere Untersuchungen zu dem Wirkstoff (-)-6k.
Mittels des High Content Screenings einer, aus 150 THPs bestehenden Substanzbibliothek
wurden Tubulexin A, B und C als antimitotische Substanzen identifiziert. Die zelluläre
Untersuchung dieser Substanzen zeigte eine Induktion von G2/M-Arrest und Apoptose im
niedrig mikromolaren Bereich. Außerdem inhibierten die Substanzen die MTRepolymerisation
kältebehandelter BSC-1 Zellen. Die Studien zeigten somit ein
gemeinsames Wirkprinzip der Tubulexine. Zur Identifikation des Zielproteins des bioaktivsten
Derivates Tubulexin A wurde ein quantitativer, proteomischer Ansatz mittels SILAC basierter
komparativer Affinitätschromatographie verwendet. Anhand dieses Ansatzes wurden, unter
Berücksichtigung der zellulären Studien, αβ-Tubulin und CAS als potentielle Zielproteine
identifiziert. Die Isolation durch die Tubulexin A Affinitätssonde konnte durch
Immunodetektion bestätigt werden. Nachfolgend konnte die spezifische und physiologisch
relevante Bindung von Tubulexin A an αβ Tubulin durch die inhibitorische Wirkung der
Substanz auf die in vitro Tubulin-Polymerisation validiert werden. Dieses Ergebnis
verdeutlichte, dass der zelluläre Effekt von Tubulexin A unabhängig von CAS erklärbar ist.
Des Weiteren ist gezeigt worden, dass Tubulexin A ein potenter Ligand der Vinca Alkaloid-
Bindestelle von αβ Tubulin ist: Unter den gewählten Bedingungen war dessen
stöchiometrische Bindung an das Protein mit derer von Vinblastin vergleichbar.
Die physiologische Wirkung von Tubulexin A betreffend ist neben einer spezifischen Bindung
von αβ-Tubulin ein synergetischer Wirkmechanismus mit dem Protein CAS denkbar. Die
Untersuchung eines solchen etwaigen Mechanismus bietet einen attraktiven Ausgangspunkt
für weitere Studien. Aufgrund ihrer interessanten Bioaktivität, chemischen Zugänglichkeit,
unverminderten Wirkung gegenüber Taxol resistente Zellen und einer möglichen
synergetischen Wirkung auf αβ-Tubulin und CAS stellen die Tubulexine interessante
Leitmotive für die Synthese Tubulexin-basierter Substanzbibliotheken dar. Es ist
wahrscheinlich, dass hierdurch Substanzen mit größerer Potenz und erhöhter Selektivität
gegenüber den Zielproteinen erhalten werden können.
Description
Table of contents
Keywords
Chemische Genetik, Mitose, Screening, Mikrotubuli