Investigations of protein-ligand interactions with in vitro and in silico methods
Loading...
Date
2025
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Alternative Title(s)
Abstract
Strukturbasiertes Design ermöglicht es Forschenden, gezielt Moleküle zu entwickeln, die spezifisch mit Zielstrukturen, häufig Proteinen, interagieren, und diese weiter zu optimieren, um schließlich zu einem zugelassenen Medikament zu gelangen. Das Matched Molecular Pair (MMP) Sorafenib und Regorafenib, zwei zugelassene Medikamente, wurde mit isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) untersucht, da strukturelle Vorarbeiten auf eine große Änderung ausgehend von der H -> F Substitution an einem aromatischen Ring schließen ließen. Obwohl die Substitution die Affinität um mehrere Zehnerpotenzen verändern kann, wie in einer MMP-Analyse basierend auf Kinom-Aktivitätsdaten aus der ChEMBL-Datenbank gezeigt wurde, hatten sowohl die Affinitäten als auch die thermodynamischen Profile der Bindungsreaktion mit der Mitogen-aktivierten Proteinkinase p38α nur marginale Unterschiede aufweisen können.
Fragmentbasierte Ansätze erwiesen sich sowohl im akademischen Umfeld als auch in der pharmazeutisch-industriellen Forschung bei der Entwicklung von zugelassenen Wirkstoffen erfolgreich. Drei von fünf Hits aus zwei kristallographischen Fragment-Screens konnten kalorimetrisch validiert werden. Für ein weiteres Fragment konnten pKa-Rechnungen einen Protonierungseffekt durch die Komplexierung an der Proteinkinase A aufzeigen.
Diese Ergebnisse waren der Ausgangspunkt für weitere detaillierte Untersuchungen zu Protonierungseffekten, da deren korrekte Behandlung die Erfolgschancen im strukturbasierten Design erhöhen kann. Die Interaktion der Aspartylprotease Endothiapepsin und Pepstatin A wurde mittels verschiedener Labor- und Computermethoden untersucht. ITC-Experimente ergaben eine Aufnahme von über 1 mol Protonen bei der Bindung von Pepstatin A an Endothiapepsin. Da diese Experimente unter physiologischen Bedingungen durchgeführt wurden (und nicht bei pH=4.6, bei dem eine große Anzahl an Kristallstrukturen verfügbar ist), wurde eine neue Kristallstruktur bei pH=7.6 bestimmt, die nur kleine strukturelle Änderungen durch das Erhöhen des pH-Werts hervorbrachte. Dies war die Basis für computerbasierte Studien, um den genauen Ort des Protonierungsereignisses zu ermitteln. Beide computerbasierten Ansätze zeigten eine signifikante pKa-Verschiebung, die zu einem nicht-standardmäßigen Protonierungszustand führt, und dass die katalytische Dyade für die Aufnahme von Protonen bei der Komplexierung verantwortlich ist. Diese Studie zeigt, dass die Bewertung der Protonierungszustände für zwei getrennte Systeme (Protein und Ligand) zu einer falschen Zuordnung der Protonierungszustände und damit zu einer falschen Berechnung der Bindungsenergie führen kann.
Weitere Fallstudien an Komplexen zweier Aspartylproteasen mit unserem computerbasierten Ansatz zeigten, dass die Interaktion von Ligand und Protein zu großen pKa-Verschiebungen von mehr als drei Einheiten führen kann, die es in Folgeexperimenten zu bestätigen gilt.
Der pKa-Wert der Thiol-/Thiolatgruppe des Cysteins spielt in der Wirkstoffentwicklung eine besondere Rolle, da diese häufig das Ziel kovalenter Inhibitoren sind. Diesen Wert experimentell zu bestimmen ist sehr schwierig. Durch die Bestimmung des pKa von Cystein13 in der G13C-Mutante der GTPase KRas mit einem computerbasierten Ansatz wurde gezeigt, dass das Schwefelatom von kovalenten Inhibitoren angegriffen werden kann.
Ligandenbasiertes virtuelles Screening ist eine weit verbreitete Methode in der modernen Wirkstoffentwicklung, die es ermöglicht, große Datenbanken von Verbindungen schnell nach ähnlichen Strukturen zu durchsuchen und diese zu identifizieren. In diesem Rahmen wurde ein Open-Source-Kommandozeilentool entwickelt, das ein substruktur-, fingerprint- und shapebasiertes virtuelles Screening umfasst. Die meisten der implementierten Funktionen basieren vollständig auf dem Chemieinformatik-Framework RDKit. VSFlow akzeptiert eine breite Palette von Eingabedateiformaten und ist in hohem Maße konfigurierbar. Darüber hinaus können die Screening-Ergebnisse als pdf- und/oder pymol-Datei visualisiert werden.
Structure-based design enables researchers to develop molecules that specifically interact with target structures, often proteins, and optimize them to ultimately become approved drugs. The MMP sorafenib and regorafenib, two approved drugs, were investigated using \gls{ITC}, because structural groundwork suggested a significant change resulting from the H -> F substitution on an aromatic ring. Although the substitution can alter affinity by several orders of magnitude, as shown in an MMP analysis based on kinase activity data from the ChEMBL database, both affinities and thermodynamic profiles of the binding reaction with p38α showed only marginal differences. Fragment-based approaches have proven successful in both academia and pharmaceutical industry research for developing approved drugs. Three out of five hits from two crystallographic fragment screens could be calorimetrically validated. For another fragment, pKa calculations revealed a protonation effect upon complexation with protein kinase A. These results served as the starting point for further detailed investigations of protonation effects, as their correct handling can increase success rates in structure-based design. The interaction of the aspartic protease Endothiapepsin and Pepstatin A was studied using various laboratory and computational methods. ITC experiments revealed an uptake of over 1 mol of protons upon binding of Pepstatin A to Endothiapepsin. Since these experiments were performed under physiological conditions (and not at pH = 4.6, where a large number of crystal structures are available), a new crystal structure was determined at pH = 7.6, which showed only minor structural changes due to the increase in pH value. Based on this, computational studies were performed to determine the exact location of the protonation event. Both computational approaches showed a significant pKa shift leading to a non-standard protonation state and that the catalytic dyad is responsible for proton uptake upon complexation. This study demonstrates that evaluating protonation states for two separate systems (protein and ligand) can lead to incorrect assignment of protonation states and, consequently, to inaccurate calculation of binding energy. Further case studies on complexes of two aspartic proteases with our computational approach showed that the interaction of ligand and protein can lead to large pKa shifts of more than three units, which need to be confirmed in follow-up experiments. The pKa value of the thiol/thiolate group of cysteine plays a special role in drug development, as it is often the target of covalent inhibitors. Experimentally determining this value is very difficult. By determining the pKa of cysteine13 in the G13C mutant of the GTPase KRas with a computational approach, it was shown that the sulfur atom can be attacked by covalent inhibitors. Ligand-based virtual screening is a widespread method in modern drug development, allowing rapid searching and identification of similar structures within large compound databases. In this context, an open-source command-line tool has been developed that encompasses substructure-, fingerprint-, and shape-based virtual screening. Most of the implemented functions are entirely based on the cheminformatics framework RDKit. VSFlow can process a wide range of input file formats and is highly configurable. Additionally, screening results can be visualized as pdf and/or pymol files.
Structure-based design enables researchers to develop molecules that specifically interact with target structures, often proteins, and optimize them to ultimately become approved drugs. The MMP sorafenib and regorafenib, two approved drugs, were investigated using \gls{ITC}, because structural groundwork suggested a significant change resulting from the H -> F substitution on an aromatic ring. Although the substitution can alter affinity by several orders of magnitude, as shown in an MMP analysis based on kinase activity data from the ChEMBL database, both affinities and thermodynamic profiles of the binding reaction with p38α showed only marginal differences. Fragment-based approaches have proven successful in both academia and pharmaceutical industry research for developing approved drugs. Three out of five hits from two crystallographic fragment screens could be calorimetrically validated. For another fragment, pKa calculations revealed a protonation effect upon complexation with protein kinase A. These results served as the starting point for further detailed investigations of protonation effects, as their correct handling can increase success rates in structure-based design. The interaction of the aspartic protease Endothiapepsin and Pepstatin A was studied using various laboratory and computational methods. ITC experiments revealed an uptake of over 1 mol of protons upon binding of Pepstatin A to Endothiapepsin. Since these experiments were performed under physiological conditions (and not at pH = 4.6, where a large number of crystal structures are available), a new crystal structure was determined at pH = 7.6, which showed only minor structural changes due to the increase in pH value. Based on this, computational studies were performed to determine the exact location of the protonation event. Both computational approaches showed a significant pKa shift leading to a non-standard protonation state and that the catalytic dyad is responsible for proton uptake upon complexation. This study demonstrates that evaluating protonation states for two separate systems (protein and ligand) can lead to incorrect assignment of protonation states and, consequently, to inaccurate calculation of binding energy. Further case studies on complexes of two aspartic proteases with our computational approach showed that the interaction of ligand and protein can lead to large pKa shifts of more than three units, which need to be confirmed in follow-up experiments. The pKa value of the thiol/thiolate group of cysteine plays a special role in drug development, as it is often the target of covalent inhibitors. Experimentally determining this value is very difficult. By determining the pKa of cysteine13 in the G13C mutant of the GTPase KRas with a computational approach, it was shown that the sulfur atom can be attacked by covalent inhibitors. Ligand-based virtual screening is a widespread method in modern drug development, allowing rapid searching and identification of similar structures within large compound databases. In this context, an open-source command-line tool has been developed that encompasses substructure-, fingerprint-, and shape-based virtual screening. Most of the implemented functions are entirely based on the cheminformatics framework RDKit. VSFlow can process a wide range of input file formats and is highly configurable. Additionally, screening results can be visualized as pdf and/or pymol files.
Description
Table of contents
Keywords
Protein-ligand interactions, pKa, Protonation effects, Isothermal titration calorimetry
Subjects based on RSWK
Kalorimetrie, Protonentransfer