Fakultät für Chemie und Chemische Biologie

Permanent URI for this collection

http://hdl.handle.net/2003/39253

Browse

Now showing 1 - 20 of 24

Sedimentation of large, soluble proteins up to 140 kDa for 1H-detected MAS NMR and 13C DNP NMR – practical aspects
(2024-06-21) Bell, Dallas; Lindemann, Florian; Gerland, Lisa; Aucharova, Hanna; Klein, Alexander; Friedrich, Daniel; Hiller, Matthias; Grohe, Kristof; Meier, Tobias; van Rossum, Barth; Diehl, Anne; Hughes, Jon; Mueller, Leonard J.; Linser, Rasmus; Miller, Anne-Frances; Oschkinat, Hartmut
Solution NMR is typically applied to biological systems with molecular weights < 40 kDa whereas magic-angle-spinning (MAS) solid-state NMR traditionally targets very large, oligomeric proteins and complexes exceeding 500 kDa in mass, including fibrils and crystalline protein preparations. Here, we propose that the gap between these size regimes can be filled by the approach presented that enables investigation of large, soluble and fully protonated proteins in the range of 40–140 kDa. As a key step, ultracentrifugation produces a highly concentrated, gel-like state, resembling a dense phase in spontaneous liquid-liquid phase separation (LLPS). By means of three examples, a Sulfolobus acidocaldarius bifurcating electron transfer flavoprotein (SaETF), tryptophan synthases from Salmonella typhimurium (StTS) and their dimeric β-subunits from Pyrococcus furiosus (PfTrpB), we show that such samples yield well-resolved proton-detected 2D and 3D NMR spectra at 100 kHz MAS without heterogeneous broadening, similar to diluted liquids. Herein, we provide practical guidance on centrifugation conditions and tools, sample behavior, and line widths expected. We demonstrate that the observed chemical shifts correspond to those obtained from µM/low mM solutions or crystalline samples, indicating structural integrity. Nitrogen line widths as low as 20–30 Hz are observed. The presented approach is advantageous for proteins or nucleic acids that cannot be deuterated due to the expression system used, or where relevant protons cannot be re-incorporated after expression in deuterated medium, and it circumvents crystallization. Importantly, it allows the use of low-glycerol buffers in dynamic nuclear polarization (DNP) NMR of proteins as demonstrated with the cyanobacterial phytochrome Cph1.
Epigenetic CpG duplex marks probed by an evolved DNA reader via a well-tempered conformational plasticity
(2023-03-15) Singh, Himanshu; Das, Chandan K.; Buchmuller, Benjamin C.; Schäfer, Lars V.; Summerer, Daniel; Linser, Rasmus
5-methylcytosine (mC) and its TET-oxidized derivatives exist in CpG dyads of mammalian DNA and regulate cell fate, but how their individual combinations in the two strands of a CpG act as distinct regulatory signals is poorly understood. Readers that selectively recognize such novel ‘CpG duplex marks’ could be versatile tools for studying their biological functions, but their design represents an unprecedented selectivity challenge. By mutational studies, NMR relaxation, and MD simulations, we here show that the selectivity of the first designer reader for an oxidized CpG duplex mark hinges on precisely tempered conformational plasticity of the scaffold adopted during directed evolution. Our observations reveal the critical aspect of defined motional features in this novel reader for affinity and specificity in the DNA/protein interaction, providing unexpected prospects for further design progress in this novel area of DNA recognition.
Evolved DNA duplex readers for strand-asymmetrically modified 5-hydroxymethylcytosine/5-methylcytosine CpG dyads
(2022-02-14) Buchmuller, Benjamin C.; Dröden, Jessica; Singh, Himanshu; Palei, Shubhendu; Drescher , Malte; Linser, Rasmus; Summerer, Daniel
5-Methylcytosine (mC) and 5-hydroxymethylcytosine (hmC), the two main epigenetic modifications of mammalian DNA, exist in symmetric and asymmetric combinations in the two strands of CpG dyads. However, revealing such combinations in single DNA duplexes is a significant challenge. Here, we evolve methyl-CpG-binding domains (MBDs) derived from MeCP2 by bacterial cell surface display, resulting in the first affinity probes for hmC/mC CpGs. One mutant has low nanomolar affinity for a single hmC/mC CpG, discriminates against all 14 other modified CpG dyads, and rivals the selectivity of wild-type MeCP2. Structural studies indicate that this protein has a conserved scaffold and recognizes hmC and mC with two dedicated sets of residues. The mutant allows us to selectively address and enrich hmC/mC-containing DNA fragments from genomic DNA backgrounds. We anticipate that this novel probe will be a versatile tool to unravel the function of hmC/mC marks in diverse aspects of chromatin biology.
Atomic-resolution chemical characterization of (2x)72-kDa tryptophan synthase via four- and five-dimensional 1H-detected solid-state NMR
(2022-01-20) Klein, Alexander; Rovó, Petra; Sakhrani, Varun V.; Wang, Yangyang; Holmes, Jacob B.; Liu, Viktoriia; Skowronek, Patricia; Kukuk, Laura; Vasa, Suresh K.; Güntert, Peter; Mueller, Leonard J.; Linser, Rasmus
NMR chemical shifts provide detailed information on the chemical properties of molecules, thereby complementing structural data from techniques like X-ray crystallography and electron microscopy. Detailed analysis of protein NMR data, however, often hinges on comprehensive, site-specific assignment of backbone resonances, which becomes a bottleneck for molecular weights beyond 40 to 45 kDa. Here, we show that assignments for the (2x)72-kDa protein tryptophan synthase (665 amino acids per asymmetric unit) can be achieved via higher-dimensional, proton-detected, solid-state NMR using a single, 1-mg, uniformly labeled, microcrystalline sample. This framework grants access to atom-specific characterization of chemical properties and relaxation for the backbone and side chains, including those residues important for the catalytic turnover. Combined with first-principles calculations, the chemical shifts in the β-subunit active site suggest a connection between active-site chemistry, the electrostatic environment, and catalytically important dynamics of the portal to the β-subunit from solution.
Mitochondrial lysophosphatidic acid generating enzymes glycerol-3-phosphate acyltransferase 1 and acylglycerol kinase are associated with ovarian cancer cell migration.
(2025) Gonscharow, Anastasia; Hengstler, Jan G.; Dehmelt, Leif
Metastasen bleiben die Hauptursache für die Sterblichkeit bei Eierstockkrebs, insbesondere bei hochgradigem serösem Eierstockkrebs (HGSOC), der als der häufigste und aggressivste Subtyp bekannt ist. Der Prozess der Tumormetastasierung ist eng mit der metabolischen Umprogrammierung verbunden, einschließlich Veränderungen in der Verstoffwechselung der Glycerophospholipiden. Unsere vorherige Forschung hat gezeigt, dass eine hohe Expression des mitochondrialen Enzyms Glycerol-3-phosphat-Acyltransferase 1 (GPAM), das den ersten Schritt in der Triglyceridsynthese katalysiert, mit einer schlechten Prognose bei Eierstockkrebs assoziiert ist. Neuere unveröffentlichte Daten haben zudem gezeigt, dass die GPAM-Expression in omentalen Metastasen signifikant höher ist im Vergleich zu primären Tumorgeweben von Eierstockkrebspatientinnen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Herunterregulierung von GPAM in verschiedenen Krebszelllinien die Zellmigration, ein wichtiger Faktor bei der Tumormetastasierung, signifikant reduzierte. Im Gegensatz dazu erhöhte die Überexpression von GPAM in HEK293-Zellen deren Migrationsfähigkeit. In vivo war die Herunterregulierung von GPAM in der Eierstockkrebs-Zelllinie ES2 mit einem reduzierten Tumorwachstum in einem subkutanen Xenograft-Mausmodell assoziiert. GPAM katalysiert die Produktion des bioaktiven Signallipids, Lysophosphatidsäure (LPA), durch die Acylierung von Glycerol-3-phosphat (G3P), und in vitro-Studien in Brustkrebszellen zeigten eine Assoziation zwischen intrazellulären LPA-Spiegeln und der Migrationsfähigkeit der Zellen. Neben GPAM kann auch eine Reihe anderer Enzyme, einschließlich der Acylglycerolkinase (AGK) intrazellulär LPA produzieren. Desweiteren wird das Enzym AGK zunehmend mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht wird. Insgesamt motivierten diese vorherigen Ergebnisse die vorliegende Studie, die darauf abzielt, die Rollen der intrazellulären LPA-produzierenden Enzyme GPAM und AGK in krebsbezogenen Prozessen bei HGSOC zu untersuchen. In dieser Studie wurde zunächst ein Panel von Eierstockkrebszelllinien verwendet, um die basale Expression von GPAM und AGK sowie die intrazellulären Lipidprofile und die Migrationsfähigkeit der Zellen zu charakterisieren, um geeignete Modelle für die funktionale Analyse zu identifizieren. Fünf HGSOC-Zelllinien wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Die Herunterregulierung von GPAM und AGK mittels siRNA führte in allen Zelllinien konsistent zu einer signifikanten Reduktion der Zellmigration. Darüber hinaus zeigten OVCAR8-Zellen nach dem Stilllegen von sowohl GPAM als auch AGK eine gestörte Sphäroidbildung und -ausbreitung. Die stabile Überexpression von AGK erhöhte sowohl die Zellmigration als auch die Sphäroidbildung, was auf die Rolle von AGK bei der Förderung krebsrelevanter Phänotypen hinweist. Verschiedene Endpunkte wurden untersucht, um den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen, durch den GPAM und AGK die Migration sowie die Sphäroidbildung und -ausbreitung regulieren. Interessanterweise ergab die gezielte Lipidomik-Analyse mit Massenspektrometrie keine konsistenten Veränderungen der intrazellulären LPA-Spiegel oder von assoziierten Metaboliten, Phosphatidsäure (PA) und Diacylglycerol (DAG), nach dem Stilllegen von GPAM und AGK, was darauf hindeutet, dass die beobachteten Effekte auf das Zellverhalten möglicherweise nicht direkt durch Veränderungen der Lipidspiegel vermittelt werden. Die Analyse der Genexpression mit RT-qPCR zeigte zelllinien-spezifische kompensatorische Veränderungen in anderen LPA-produzierenden Enzymen, einschließlich GPAT-Isoformen; jedoch waren diese Veränderungen zwischen den Zelllinien inkonsistent und konnten die beobachteten Veränderungen in den Lipidprofilen nicht erklären. Darüber hinaus zeigte die Proteinexpression klassischer Marker für den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) wie E-Cadherin, N-Cadherin und Vimentin sowie die Aktivität der RhoA-GTPase in den OVCAR8-Zellen keine Veränderungen bei der Modulation der GPAM- und AGK-Expression. Das Stilllegen von sowohl GPAM als auch AGK in OVCAR8-Zellen führte jedoch zu einer reduzierten Phosphorylierung wichtiger Signalmoleküle wie Akt, ERK und GSK3β. Schließlich wurden aufgrund ihrer mitochondrialen Lage und früherer Studien, die potenzielle Rollen für sowohl GPAM als auch AGK bei der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Integrität vorschlugen, erste Studien durchgeführt, um den Effekt des Stilllegens von GPAM und AGK und der Überexpression von AGK auf die mitochondriale Funktion mithilfe des Seahorse Mitochondrial Stress Test-Assays zu untersuchen. Interessanterweise wurde eine konsistenten Anstieg der nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauchsrate nach dem Stilllegen von sowohl GPAM als auch AGK, zusammen mit einer Reduktion in Zellen, die AGK überexprimieren, beobachtet. Zusätzlich zeigten die Ergebnisse signifikante Veränderungen in der respiratorischen Funktion in Zellen mit deregulierter AGK-Expression. Zusammenfassend etabliert diese Studie GPAM und AGK als entscheidende Regulatoren der Zellmigration, Sphäroidbildung und mitochondrialen Funktion bei HGSOC, unabhängig von Veränderungen der intrazellulären Lipidspiegel oder EMT-Markern.
Drop dilution enables the use of PEG-derived detergents for membrane protein purification
(2025-11-14) Alker, Katharina; Singh, Shweta; Vinodakrishnan, Arun K.; Lindemann, Florian; Linser, Rasmus; Singh, Ram; Singh, Abhishek; Urner, Leonhard H.
PEG detergents are important tools in the biophysical characterization of membrane protein whose utility is often limited by their intrinsic denaturing properties. This work addresses the question of whether changing the linker between PEG headgroup and nonpolar tail can modulate the denaturing properties of these detergents. To address this question, herein, we introduce the modular architecture of PEG550 detergents and explore its utility for protein purification from membranes and detergent exchange. Our results indicate that PEG550 detergents cannot efficiently solubilize proteins from lysed bacterial membranes. Varying the linker cannot eliminate the denaturing properties that PEG550 detergents can have on a protein during extraction and affinity purification. Interestingly, we find that PEG550 detergents can preserve the secondary structure and activity of the model membrane protein vitamin B12 transporter as good as the reference detergent n-dodecyl-β-D-maltoside following detergent exchange via drop dilution. Our findings clarify that denaturing properties of PEG550 detergents depend on both their chemical structure and the detergent exchange method with which proteins and detergents are brought together. Our drop dilution conditions are representative of those frequently employed in the biophysical characterization of membrane proteins. We anticipate PEG550 detergents will deliver a starting point for the optimization of sample properties in the biophysical characterization of membrane proteins.
A nanoporous hydrogel-based model to study chemokine gradient-driven angiogenesis under luminal flow
(2024-09-11) Mote, Nidhi; Kubik, Sarah; Polacheck, William J.; Baker, Brendon M.; Trappmann, Britta
The growth of new blood vessels through angiogenesis is a highly coordinated process, which is initiated by chemokine gradients that activate endothelial cells within a perfused parent vessel to sprout into the surrounding 3D tissue matrix. While both biochemical signals from pro-angiogenic factors, as well as mechanical cues originating from luminal fluid flow that exerts shear stress on the vessel wall, have individually been identified as major regulators of endothelial cell sprouting, it remains unclear whether and how both types of cues synergize. To fill this knowledge gap, here, we created a 3D biomimetic model of chemokine gradient-driven angiogenic sprouting, in which a micromolded tube inside a hydrogel matrix is seeded with endothelial cells and connected to a perfusion system to control fluid flow rates and resulting shear forces on the vessel wall. To allow for the formation of chemokine gradients despite the presence of luminal flow, a nanoporous synthetic hydrogel that supports angiogenesis but limits the interstitial flow proved crucial. Using this system, we find that luminal flow and resulting shear stress is a major regulator of the speed and morphogenesis of angiogenic sprouting, whose action is mediated through changes in vascular permeability.
Entry mechanism of natural killer cell derived granzyme B into target cells
(2025) Bruning, Nora; Watzl, Carsten; Carsten, Philipp
During elimination of virally infected or malignant cells, NK cells release lytic granules. These contain perforin and granzyme B (GrzB), which synergistically trigger apoptosis of affected cells. However, despite intensive research, the mechanism by which GrzB traverses membrane barriers to gain access to the target cell cytosol is controversial. Two main entry models have been described: I) perforin pores in the plasma membrane (PM) act as passageways for GrzB to allow direct diffusion into the cytosol or II) target cells internalize GrzB via endocytosis followed by a release from endosomes. Yet, mutual exclusivity is not necessarily a given; both pathways could also support each other. To investigate how GrzB enters target cells during NK cell-mediated cytotoxicity, we developed fluorescent localization reporters that can detect GrzB activity in living cells. We can localize these reporters at the PM, the endoplasmic reticulum (ER), or other intracellular compartments of target cells. Therefore, it becomes possible to assess the GrzB entry site over time using live cell imaging. Using the NK cell line NK92 or different human primary NK cells as effectors and HeLa cells as targets, we could observe a predominant GrzB activity at the PM of target cells; but low GrzB activity was also detected at the ER. This could indicate either a mutual supportive role of both pathways or diffusion of GrzB from the PM to the ER. However, we did not observe GrzB activity at mitochondria arguing against general diffusion of GrzB. By reducing the amount of active perforin with concanamycin A (CMA), we were able to show that the preferential entry through PM pores is independent of the available amount of perforin. However, in the absence of perforin, no GrzB activity was detectable in target cells, confirming the essential role of perforin for GrzB to enter target cells. Taken together, our results demonstrate that during NK cell-mediated killing GrzB enters HeLa directly via the PM. However, we found differences between target cells. K562 were almost exclusively killed without GrzB, while we found rare events in MDA-MB #468 cells where GrzB was predominantly delivered via the endocytic pathway, which may be enhanced by altering membrane tension.
Investigations of protein-ligand interactions with in vitro and in silico methods
(2025) Vatheuer, Helge; Czodrowski, Paul; Rauh, Daniel
Strukturbasiertes Design ermöglicht es Forschenden, gezielt Moleküle zu entwickeln, die spezifisch mit Zielstrukturen, häufig Proteinen, interagieren, und diese weiter zu optimieren, um schließlich zu einem zugelassenen Medikament zu gelangen. Das Matched Molecular Pair (MMP) Sorafenib und Regorafenib, zwei zugelassene Medikamente, wurde mit isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) untersucht, da strukturelle Vorarbeiten auf eine große Änderung ausgehend von der H -> F Substitution an einem aromatischen Ring schließen ließen. Obwohl die Substitution die Affinität um mehrere Zehnerpotenzen verändern kann, wie in einer MMP-Analyse basierend auf Kinom-Aktivitätsdaten aus der ChEMBL-Datenbank gezeigt wurde, hatten sowohl die Affinitäten als auch die thermodynamischen Profile der Bindungsreaktion mit der Mitogen-aktivierten Proteinkinase p38α nur marginale Unterschiede aufweisen können. Fragmentbasierte Ansätze erwiesen sich sowohl im akademischen Umfeld als auch in der pharmazeutisch-industriellen Forschung bei der Entwicklung von zugelassenen Wirkstoffen erfolgreich. Drei von fünf Hits aus zwei kristallographischen Fragment-Screens konnten kalorimetrisch validiert werden. Für ein weiteres Fragment konnten pKa-Rechnungen einen Protonierungseffekt durch die Komplexierung an der Proteinkinase A aufzeigen. Diese Ergebnisse waren der Ausgangspunkt für weitere detaillierte Untersuchungen zu Protonierungseffekten, da deren korrekte Behandlung die Erfolgschancen im strukturbasierten Design erhöhen kann. Die Interaktion der Aspartylprotease Endothiapepsin und Pepstatin A wurde mittels verschiedener Labor- und Computermethoden untersucht. ITC-Experimente ergaben eine Aufnahme von über 1 mol Protonen bei der Bindung von Pepstatin A an Endothiapepsin. Da diese Experimente unter physiologischen Bedingungen durchgeführt wurden (und nicht bei pH=4.6, bei dem eine große Anzahl an Kristallstrukturen verfügbar ist), wurde eine neue Kristallstruktur bei pH=7.6 bestimmt, die nur kleine strukturelle Änderungen durch das Erhöhen des pH-Werts hervorbrachte. Dies war die Basis für computerbasierte Studien, um den genauen Ort des Protonierungsereignisses zu ermitteln. Beide computerbasierten Ansätze zeigten eine signifikante pKa-Verschiebung, die zu einem nicht-standardmäßigen Protonierungszustand führt, und dass die katalytische Dyade für die Aufnahme von Protonen bei der Komplexierung verantwortlich ist. Diese Studie zeigt, dass die Bewertung der Protonierungszustände für zwei getrennte Systeme (Protein und Ligand) zu einer falschen Zuordnung der Protonierungszustände und damit zu einer falschen Berechnung der Bindungsenergie führen kann. Weitere Fallstudien an Komplexen zweier Aspartylproteasen mit unserem computerbasierten Ansatz zeigten, dass die Interaktion von Ligand und Protein zu großen pKa-Verschiebungen von mehr als drei Einheiten führen kann, die es in Folgeexperimenten zu bestätigen gilt. Der pKa-Wert der Thiol-/Thiolatgruppe des Cysteins spielt in der Wirkstoffentwicklung eine besondere Rolle, da diese häufig das Ziel kovalenter Inhibitoren sind. Diesen Wert experimentell zu bestimmen ist sehr schwierig. Durch die Bestimmung des pKa von Cystein13 in der G13C-Mutante der GTPase KRas mit einem computerbasierten Ansatz wurde gezeigt, dass das Schwefelatom von kovalenten Inhibitoren angegriffen werden kann. Ligandenbasiertes virtuelles Screening ist eine weit verbreitete Methode in der modernen Wirkstoffentwicklung, die es ermöglicht, große Datenbanken von Verbindungen schnell nach ähnlichen Strukturen zu durchsuchen und diese zu identifizieren. In diesem Rahmen wurde ein Open-Source-Kommandozeilentool entwickelt, das ein substruktur-, fingerprint- und shapebasiertes virtuelles Screening umfasst. Die meisten der implementierten Funktionen basieren vollständig auf dem Chemieinformatik-Framework RDKit. VSFlow akzeptiert eine breite Palette von Eingabedateiformaten und ist in hohem Maße konfigurierbar. Darüber hinaus können die Screening-Ergebnisse als pdf- und/oder pymol-Datei visualisiert werden.
The role of LIPG in regulating cholesterol homeostasis in cancer
(2024) Mahmoud, Zhwan; Hengstler, Jan G.; Thriel, Christoph van
The endothelilal lipase or lipase G (LIPG) is expressed in cancer cells and high LIPG expression is shown to be associated with shorter metastasis free survival in untreated woman with node-negative breast cancer. LIPG is a cell surface associated lipase with multifaceted roles. It displays phospholipase A1 activity towards phosphatidylcholine in high-density lipoproteins (HDL), thereby releasing lysophosphatidylcholine (LPC) and free fatty acids, which can be used by the cells. In addition, LIPG has a non-enzymatic bridging function, enhancing the docking of lipoproteins to the cell surface. This could influence cholesterol exchange between cells and lipoproteins. Despite the important role of cholesterol tumor progression, the contribution of LIPG in tumor cholesterol homeostasis has not been studied so far. Thus, this study addresses the impact of LIPG on cholesterol metabolism in cancer cells.
Tunable synthetic hydrogels to study angiogenic sprouting
(2023-08-09) Trapani, Giuseppe; Weiß, Martin Sebastian; Trappmann, Britta
Angiogenic sprouting, the formation of new blood vessels from pre-existing vasculature, is tightly regulated by the properties of the surrounding tissue microenvironment. Although the extracellular matrix has been shown to be a major regulator of this process, it is not clear how individual biochemical and mechanical properties influence endothelial cell sprouting. This information gap is largely due to the lack of suitable in vitro models that recapitulate angiogenic sprouting in a 3D environment with independent control over matrix properties. Here, we present protocols for the preparation of endothelial cell spheroid-laden synthetic, dextran-based hydrogels, which serve as a highly tunable 3D scaffold. The adjustment of the hydrogels’ adhesiveness, stiffness, and degradability is demonstrated in detail. Finally, we describe assays to elucidate how individual matrix properties regulate angiogenic sprouting, including their analysis by immunofluorescence staining and imaging. © 2023 The Authors. Current Protocols published by Wiley Periodicals LLC. Basic Protocol 1: Synthesis of methacrylated dextran (DexMA) Basic Protocol 2: Generation of endothelial cell spheroids in microwells Basic Protocol 3: Endothelial cell sprouting in hydrogels of tunable stiffness Basic Protocol 4: Endothelial cell sprouting in hydrogels of tunable adhesiveness Basic Protocol 5: Endothelial cell sprouting in hydrogels of tunable degradability Basic Protocol 6: Imaging of endothelial cell spheroid-laden hydrogels Support Protocol 1: Preparation of pro-angiogenic cocktail for endothelial cell sprouting
The critical role of oxalate in the liver-kidney axis and its effect on glucose metabolism
(2024) Gabrys, Philipp; Hengstler, Jan G.; Thriel, Christoph van
Glucose metabolism is a highly regulated and conserved pathway orchestrated by several factors like hormones, nutritional state and enzymes. The organs, which are responsible to maintain normal blood glucose levels are the liver the kidney. Under prolonged fasting, the body makes use of the de novo production of glucose from non-carbohydrate substrates – mainly lactate, glycerol and amino acids. This process is called gluconeogenesis. In the non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) hepatic gluconeogenesis is frequently elevated which results in hyperglycemia and manifests the progression to type 2 diabetes mellitus. In a previous study, a steatosis-associated downregulation of the alanine-glyoxylate aminotransferase (Agxt) was observed in mouse models and patients with NAFLD, and this was accompanied by increased urinary oxalate levels. The physiological function of Agxt is to detoxify glyoxylate to prevent the formation of the harmful waste product oxalate. Therefore, decreased Agxt expression in the fatty liver could represent a mechanism that explains a higher risk of hyperoxaluria in patients with NAFLD. In addition to the well-established role of Agxt in preventing oxalate production, evidence for a role of Agxt in amino acid-driven gluconeogenesis exists, which has to date not been completely understood. At the same time, oxalate has been reported to inhibit pyruvate carboxylase, a key enzyme of the gluconeogenesis pathway. Altogether, this leads to the hypothesis, that Agxt may support gluconeogenesis by restricting oxalate generation. To investigate this hypothesis, the inhibitory effect of oxalate on gluconeogenesis was first studied in vitro. The exposure of oxalate and the oxalate precursor hydroxyproline to human and murine hepatocytes in this assay revealed an inhibitory effect of oxalate on the glucose production from pyruvate, lactate and alanine, but not from glycerol. The findings demonstrated a critical role and a direct influence of oxalate on glucose synthesis from precursors that require pyruvate carboxylase to enter the gluconeogenesis pathway.To translate the in vitro findings to an in vivo model, glucose homeostasis was studied in AgxtKO mice, which display high plasma and urinary oxalate levels. The results revealed no changes in the plasma glucose levels, but, intriguingly, a decreased body weight loss after an overnight starvation. In plasma, levels of the glucogenic amino acid glutamine were decreased after fasting in Agxt-deficient compared to wildtype mice. Glucose metabolism-associated gene expression analysis in the liver showed no difference between AgxtKO and wt mice, whereas in the kidney, gene expression changes were observed, suggesting upregulation of compensatory pathways to overcome oxalate inhibition, such as glycerol-driven gluconeogenesis. The results demonstrated that renal gluconeogenesis is more affected by oxalate in the kidney of hyperoxaluric AgxtKO mice, and when hepatic Agxt deficiency appears it affects muscle protein breakdown and glutamine release. This indicates a role of Agxt in gluconeogenesis, since other key enzymes of gluconeogenesis were also upregulated. The results suggest a small contribution of Agxt in glucose homeostasis via regulation of oxalate generation within hepatocytes. In the absence of Agxt, mice can maintain glycemia. However, the levels of oxalate generated in the liver appear to affect the kidney, as judged by the observed gene expression changes. We propose that in kidney, gluconeogenesis from glycerol and other compensatory pathways will be predominant when Agxt is downregulated and oxalate levels become high enough to inhibit gluconeogenesis via pyruvate carboxylase. Conversely, upregulation of Agxt – e.g. by glucagon or pyruvate availability - will prevent oxalate generation and allow pyruvate-driven gluconeogenesis. The hypothesis that levels of oxalate may determine substrate utilization for glucose production in glucose-producing organs like liver and kidney in health and disease should be further explored using 13C metabolic flux analysis. Finally, further experiments are also needed to understand the influence of hepatic Agxt on muscle protein breakdown.
Development of an open-source application for multiprotic small molecule pKa prediction based on machine learning and experimental data
(2024) Baltruschat, Marcel; Czodrowski, Paul; Kast, Stefan M.
Die Säure-Base-Dissoziationskonstante (pKa) und damit der Säure-Base-Charakter eines Moleküls hat einen weitreichenden Einfluss auf seine biopharmazeutischen, pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Eigenschaften. Dazu gehören unter anderem Löslichkeit, Absorption, Permeabilität, Proteinbindung und Lipophilie. Diese weitreichenden Auswirkungen sind der Grund dafür, dass pKa-Werte experimentell bestimmt und im Rahmen des Arzneimittelzulassungsverfahrens angegeben werden müssen. Eine genaue Abschätzung der pKa-Werte ist daher von entscheidender Bedeutung für ein erfolgreiches Wirkstoffdesign. Für die Vorhersage von pKa-Werten für kleine Moleküle existieren mehrere kommerzielle und nichtkommerzielle Tools und Ansätze, jedoch fehlt ein quelloffenes, frei verfügbares pKa-Vorhersagetool, das sich in seiner Vorhersagequalität und seinem Funktionsumfang mit den kommerziellen Tools messen kann. Ziel dieser Arbeit ist es, ein solches Tool zu entwickeln, welches auf maschinellem Lernen und ausschließlich experimentell ermittelten pKa-Daten basiert. Dazu wurden zunächst experimentell ermittelte pKa-Daten durch umfangreiche Literatur- und Datenbankrecherchen sowie durch Kooperationen mit verschiedenen Pharmaunternehmen und Softwareanbietern zusammengetragen und standardisiert. Anschließend wurde mit der Entwicklung eines auf maschinellem Lernen basierenden pKa-Vorhersagetools für monoprotische Moleküle begonnen. Nach der Evaluierung verschiedener Transformationsmethoden vom Molekül zu für das Training verwendbare Eingabedaten sowie verschiedener Machine-Learning-Algorithmen konnte ein Random Forest Modell entwickelt werden, das, auf Basis externer Testdatensätze aus der Literatur und der pharmazeutischen Industrie sowie einer 5-fachen Kreuzva- lidierung, mit dem kommerziellen Tool ChemAxon Marvin mithalten kann sowie die Vorhersagequalität vergleichbarer, zu diesem Zeitpunkt veröffentlichter Open-Source-Modelle übertrifft. Die 5-fache Kreuzvalidierung ergab einen MAE von 0.682, einen RMSE von 1.032 und einen R2 von 0.82. Im nächsten Schritt wurde der Fokus auf multiprotische Moleküle gelegt. Hier musste die Datenaufbereitung und Vorverarbeitung erweitert werden, um die konkreten Fragestellungen der Identifizierung und Lokalisierung von Titrationsstellen in Molekülen sowie die Zuordnung der einzelnen experimentellen pKa-Werte zu ihren jeweiligen titrierbaren Gruppen zu bearbeiten. Zu diesem Zweck wurde das Programm Multiprotic pKa Processor (MPP) entwickelt. MPP führt alle notwendigen Vorverarbeitungsschritte durch, identifiziert und lokalisiert titrierbare Gruppen und führt alle weiteren vorbereitenden Schritte durch, um einen schnellen Start des maschinellen Lernens auf Basis der bearbeiteten Datensätze zu ermöglichen. Zusätzlich wird eine detaillierte Analyse der titrierbaren Gruppen der Moleküle in den gegebenen Datensätzen durchgeführt. MPP liefert auch eine Liste von SMILES Arbitrary Target Specification (SMARTS)-Mustern, die die am häufigsten vorkommenden titrierbaren Gruppen repräsentieren und auf Basis der Eingabedatensätze generiert wurden. Insgesamt wurden 16 Datensätze aus verschiedenen Quellen mit insgesamt 84957 pKa-Werten für 26568 verschiedene Moleküle verarbeitet und für das maschinelle Lernen vorbereitet. Schließlich wurde ein multiprotisches pKa-Vorhersagemodell basierend auf der Graph Convolutional Neural Network (GCN)-Architektur auf der Grundlage der aus MPP resultierenden Datensätze entwickelt. Die Implementierung des GCN sowie die Umwandlung der Moleküle in Graphen und das Hinzufügen von Kanten- und Knoteneigenschaften erfolgte mit PyTorch und PyTorch Geometric. Zur Optimierung der Architektur und der Hyperparameter wurde eine Bayes’sche Optimierung mit 500 Durchläufen mittels Optuna durchgeführt. Die einzelnen Modelle wurden mit externen Testdatensätzen evaluiert und mit MLflow getrackt und dokumentiert. Das beste Modell erreichte über alle titrierbaren Gruppen aller mono-, di- und triprotischen Moleküle für den Literatur-Testdatensatz von Settimo et al. einen MAE von 0.414, einen RMSE von 0.587 und einen R2 von 0.929. Für den Industrie-Testdatensatz von Novartis erreichte das Modell einen MAE von 0.791, einen RMSE von 1.048 und einen R2 von 0.808. Insgesamt liegt der MAE-Wert aller Testdatensätze kombiniert bei 0.748. Im Rahmen einer erweiterten Evaluierung wurde ein zweites Modell mit den gleichen Hyperparametern und einem angepassten Trainingsdatensatz trainiert und mit den SAMPL6 und SAMPL7 Datensätzen als externe Testdatensätze evaluiert. Für den monoprotischen Teil beider Datensätze erreichte das Modell einen MAE von 0.442 bzw. 0.722, einen RMSE von 0.592 bzw. 0.907 und einen R2 von 0.915 bzw. 0.851 für SAMPL6 und SAMPL7. Im Falle von SAMPL6 können die statistischen Werte aufgrund der Filterung im Zuge der Präprozessierung nicht mit den veröffentlichten statistischen Werten verglichen werden.
Dbf4-dependent kinase promotes cell cycle controlled resection of DNA double-strand breaks and repair by homologous recombination
(2024-04-03) Galanti, Lorenzo; Peritore, Martina; Gnügge, Robert; Cannavo, Elda; Heipke, Johannes; Palumbieri, Maria Dilia; Steigenberger, Barbara; Symington, Lorraine S.; Cejka, Petr; Pfander, Boris
DNA double-strand breaks (DSBs) can be repaired by several pathways. In eukaryotes, DSB repair pathway choice occurs at the level of DNA end resection and is controlled by the cell cycle. Upon cell cycle-dependent activation, cyclin-dependent kinases (CDKs) phosphorylate resection proteins and thereby stimulate end resection and repair by homologous recombination (HR). However, inability of CDK phospho-mimetic mutants to bypass this cell cycle regulation, suggests that additional cell cycle regulators may be important. Here, we identify Dbf4-dependent kinase (DDK) as a second major cell cycle regulator of DNA end resection. Using inducible genetic and chemical inhibition of DDK in budding yeast and human cells, we show that end resection and HR require activation by DDK. Mechanistically, DDK phosphorylates at least two resection nucleases in budding yeast: the Mre11 activator Sae2, which promotes resection initiation, as well as the Dna2 nuclease, which promotes resection elongation. Notably, synthetic activation of DDK allows limited resection and HR in G1 cells, suggesting that DDK is a key component of DSB repair pathway selection.
Matrix resistance toward proteolytic cleavage controls contractility‐dependent migration modes during angiogenic sprouting
(2024-03-13) Weiß, Martin S.; Trapani, Giuseppe; Long, Hongyan; Trappmann, Britta
Tissue homeostasis and disease states rely on the formation of new blood vessels through angiogenic sprouting, which is tightly regulated by the properties of the surrounding extracellular matrix. While physical cues, such as matrix stiffness or degradability, have evolved as major regulators of cell function in tissue microenvironments, it remains unknown whether and how physical cues regulate endothelial cell migration during angiogenesis. To investigate this, a biomimetic model of angiogenic sprouting inside a tunable synthetic hydrogel is created. It is shown that endothelial cells sense the resistance of the surrounding matrix toward proteolytic cleavage and respond by adjusting their migration phenotype. The resistance cells encounter is impacted by the number of covalent matrix crosslinks, crosslink degradability, and the proteolytic activity of cells. When matrix resistance is high, cells switch from a collective to an actomyosin contractility-dependent single cellular migration mode. This switch in collectivity is accompanied by a major reorganization of the actin cytoskeleton, where stress fibers are no longer visible, and F-actin aggregates in large punctate clusters. Matrix resistance is identified as a previously unknown regulator of angiogenic sprouting and, thus, provides a mechanism by which the physical properties of the matrix impact cell migration modes through cytoskeletal remodeling.
Structural investigation of the relaxed cardiac sarcomere by electron cryo-tomography
(2024) Tamborrini, Davide; Raunser, Stefan; Dehmelt, Leif
The sarcomere is the basic unit of striated muscles and consists of interdigitating thick and thin filaments. The two types of filaments slide on each other resulting in the shortening of sarcomere itself thereby generating work. The thin filament comprises filamentous actin (F-actin), troponin (Tn), and tropomyosin (Tm). The thick filament is the force bearing part of the sarcomere and it comprises myosin, titin, and myosin-binding protein C (MyBP-C). The vast majority of the mutations responsible for familial hypertrophic cardiomyopathy and other heart and muscle diseases are borne by components of the thick filaments. However, despite its central importance, it remains unclear how thick filaments are structurally organized and how its components interact with each other and with thin filaments to enable highly regulated muscle contraction in the cardiac tissue. In this thesis, I aimed to elucidate the molecular organization of the thick and thin filaments from left ventricular myofibrils in their relaxed state. I resorted to cryo-focused ion beam milling (cryo-FIB- milling) and cryo-electron tomography (cryo-ET) to investigate the molecular architecture of the native mammalian cardiac sarcomeres. The reconstruction of the thick filament provides insight into the three-dimensional arrangement of myosin heads and tails, MyBP-C, and titin. This clarification of structural details sheds light on their interplay during muscle contraction. The positioning of myosin heads exhibits variability based on their location along the filament, indicating diverse capabilities in terms of susceptibility to strain and activation. Meanwhile, the arrangement and interactions of myosin tails follow a distinct pattern, potentially governed by the organization of three alpha and three beta titin chains resembling a spring. This hints at specialized functions of thick filament segments in length-dependent activation (LDA) and contraction. Interestingly, the three titin alpha chains extend throughout the entire length of the thick filament, in contrast to titin beta. The structural analysis further reveals that the C-terminal region of MyBP-C not only binds to myosin tails but also unexpectedly interacts directly with myosin heads. This suggests a hitherto unreported direct involvement in maintaining the myosin OFF state. Furthermore, we visualize how MyBP-C forms links between thin and thick filaments. This study provides a molecular blueprint of the cardiac sarcomere and paves the way to forthcoming research aiming to explore muscle disorders that involve sarcomeric structural components.
β2 adrenergic receptor desensitization through chronic stimulation of Natural Killer cells
(2024) Jürgens, Martin Maria; Watzl, Carsten; Capellino, Silvia
Stress is a ubiquitous phenomenon that impacts the health of populations across all social strata. While acute stress can be beneficial, chronic stress elevates the risk for various diseases. A major part of the body’s stress response operates through the Sympathetic-Adrenal-Medullary (SAM) axis, leading to the release of epinephrine. This stress mediator can impact the immune system and alter the immune defense response. Natural Killer (NK) cells play a critical role in early immune responses, defending against pathogens and malignant cells. During stressful situations, NK cells are recruited to the blood circulation within minutes. The expression of adrenergic receptors, particularly β2 adrenergic receptors (β2AR), renders them sensitive to epinephrine. This study analyzed the response of NK cells to acute and chronic β2AR stimulation. We confirmed that acute β2AR stimulation inhibits NK cell functions in vitro. Epinephrine showed potent inhibitory effects, suppressing the activation of NK cells independent of the activation signal. The β2AR stimulation reduced NK cell adhesion, IFNγ secretion, degranulation, and cytotoxicity. We could show that β2AR stimulation effectively blocked the LFA-1 activity and led to the detachment from its ligand ICAM-1. The effect was rescued through the addition of Propranolol, a beta blocker, or ADRB2 knock out implicating LFA-1 inhibition as critical role for NK cell mobilization. The metabolic analysis revealed that β2AR agonists influenced the metabolic profile upon NK cell activation, leading to a prolonged glycolysis activity displayed by Seahorse ECAR values. In contrast, chronic β2AR stimulation nullified NK cell inhibition. After five days of β2AR treatment, NK cells were no longer responsive to a β2AR agonist. Chronic β2AR stimulation did not alter protein translation but led to receptor phosphorylation through the PKA feedback loop, initiating a G-protein switch and receptor desensitization. The β2AR treatment with long-acting β2 agonist (LABA) Indacaterol and epinephrine displayed different properties. While epinephrine inhibited NK cells only transiently as long as the β2AR agonist was abundant, Indacaterol could not be washed away and continuously stimulated the receptor. For this reason, a single LABA treatment was sufficient to induce NK cell desensitization. However, peripheral NK cells from LABA-treated patients remained responsive to epinephrine. They did not exhibit inhibition but showed an overall correlation in NK cell fitness with asthma severity. Taken together, the transient, inhibitory effect of epinephrine indicate that the hormone plays a crucial role in NK cell recruitment during acute stressful situations while repeated β2AR stimulation leads to desensitization.
Biochemische und strukturbiologische Charakterisierung der Rezeptortyrosinkinasen KIT und PDGFRA
(2024) Teuber, Alina; Rauh, Daniel; Bauer, Sebastian
Die Rezeptortyrosinkinasen KIT und PDGFRA spielen eine essenzielle Rolle in einer Vielzahl von Signaltransduktionskaskaden, welche grundlegende Zellprozesse wie Proliferation und das Überleben der Zelle regulieren. Diese Signalwege werden von Liganden, die an die extrazelluläre Domäne binden, gesteuert, welche wiederum eine Rezeptor-Dimerisierung und intrazelluläre Aktivierung der katalytisch aktiven Kinasedomäne zur Folge haben. KIT und PDGFRA wurden in ~80 % bzw. in ~15 % der auftretenden Fälle von gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) als treibende Onkogene identifiziert, wobei Primärmutationen innerhalb der Rezeptoren eine Abhängigkeit von der entsprechenden Kinase und den nachgeschalteten Signalwegen induzieren. Die auftretenden Mutationen weisen zudem meist einen Liganden-unabhängigen Aktivierungsmechanismus auf, sodass die Kinasedomänen konstitutiv aktiviert vorliegen. GIST sind weitestgehend Chemotherapie- und Strahlentherapie-resistent und stellen deshalb seit Jahrzehnten eine schwer zu behandelnde Krebserkrankung mit schlechter Prognose für die Patienten dar. Seit Anfang der 2000er Jahre wird neben der Chemo- oder Strahlentherapie auch vermehrt die Präzisionsonkologie zur Behandlung von Krebserkrankungen angewendet. Durch die Identifizierung der treibenden Onkogene konnten speziell gegen das jeweilige Onkogen gerichtete Wirkstoffe entwickelt werden. Das Paradebeispiel hierfür stellt Imatinib dar, welches zur Inhibition der Fusionskinase BCR-ABL und somit für die Behandlung chronisch myeloischer Leukämie (CML, engl.: chronic myeloid leukemia) entwickelt wurde. In den darauffolgenden Jahren konnte ebenfalls eine Wirkung von Imatinib bei der Behandlung von GIST nachgewiesen werden. Dieses repurposing von bereits für andere Indikationen zugelassenen Wirkstoffen wurde für die Behandlung von GIST eine immer wichtigere Therapiestrategie, da bis zum Jahre 2020 kein Wirkstoff für die selektive Inhibition von KIT und PDGFRA entwickelt und zugelassen worden war. Eine große Problematik stellen unter anderem auftretende Resistenzmutationen dar, die zur Unwirksamkeit der Inhibitoren beim Patienten führen und somit ein Fortschreiten der Krankheit hervorrufen. Vor dem Hintergrund der klinischen Herausforderungen im Umgang mit GIST, insbesondere aufgrund der Entstehung von Resistenzmutationen gegenüber den zugelassenen Inhibitoren, richtet sich der Fokus dieser Arbeit auf die Evaluierung von niedermolekularen Liganden der relevanten Onkogene KIT und PDGFRA in biochemischen, biophysikalischen und strukturbiologischen Systemen. Hierfür wurden fokussierte Substanzbibliotheken, welche auf unterschiedlichen Grundgerüsten basieren, hinsichtlich ihrer inhibitorischen Potenz gegenüber den Zielproteinen KIT und PDGFRA profiliert und Struktur-Aktivitäts-Beziehungen abgeleitet. Als große Herausforderung stellte sich die Etablierung von Expressions-, Reinigungs- und Kristallisationssystemen für klinisch relevante Mutationen heraus, wobei sich bereits die Expression der Zielproteine als problematisch erwies. Deshalb wurden zusätzlich zu den bereits vorhandenen Konstrukten 19 weitere Genkonstrukte generiert, welche in der Zukunft die erfolgreiche Etablierung der genannten Systeme ermöglichen könnten. Der Großteil der hier generierten Konstrukte befindet sich zum aktuellen Zeitpunkt in einem vorläufigen Stadium und ist Gegenteil aktueller Arbeiten in der Arbeitsgruppe. Weiter wurden die Wildtyp-Proteine und die Türsteher-mutierten Varianten von KIT und PDGFRA erfolgreich heterolog in Bakterien- bzw. Insektenzellen exprimiert und säulenchromatographisch gereinigt. Die Identifizierung eines Cysteins in der backpocket und eines Cysteins in der ATP-Bindetasche der Kinasedomänen führte zur Etablierung einer fokussierten Bibliothek warhead-tragender Inhibitoren. Die gereinigten Proteine konnten somit für die Untersuchung der kovalent-modifizierenden Eigenschaften dieser Liganden in massenspektrometrischen Vermessungen verwendet, sowie für strukturbiologische Untersuchungen mittels Röntgenkristallographie eingesetzt werden. Hierdurch konnten Substanzen identifiziert werden, die nachweislich irreversibel an die Zielproteine KIT-wt und PDGFRA-T674I binden, und somit ein neuartiges Adressierungskonzept der Kinasen etabliert und validiert werden. Durch strukturelle Vergleiche der verschiedenen Inhibitortypen gebunden an ihre Zielproteine konnten Schlussfolgerungen für weitere Struktur-basierte Designstrategien neuer Inhibitoren erarbeitet werden. Initiale strukturbiologische Untersuchungen halfen, unterschiedliche Kinasekonformationen zu identifizieren und zugrundeliegende Aktivierungsmechanismen zu verstehen. Darüber hinaus wurde für den erst 2020 zugelassenen Wirkstoff Avapritinib (Ayvakit®) der detaillierte Bindungsmodus in KIT-wt, KIT-T670I und PDGFRA-T674I aufgeklärt und eine neue Subtasche in den Kinasen identifiziert, welche essenziell für die potente Bindung des Liganden ist. Insgesamt sind 43 Kristallstrukturen entstanden, wovon 32 Strukturen zum aktuellen Zeitpunkt finalisiert wurden. Von diesen finalen Strukturen wurden bereits 21 in der Protein Data Bank (PDB) veröffentlicht bzw. deponiert. Weitere 11 der insgesamt 43 Kristallstrukturen sind Gegenstand aktueller Analysen auf Geheimhaltungsbasis und werden deshalb im Rahmen dieser Arbeit nicht diskutiert. In Kombination mit den erhaltenen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen legten die Kristallstrukturen einen Grundstein für das Design optimierter Liganden zur Adressierung von KIT und PDGFRA im Kontext von GIST. Zusammen mit der Aufklärung von auftretenden Resistenzmutationen können entscheidende Informationen für die Weiterentwicklung von Therapieansätzen erhalten werden. Die im Rahmen dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse ermöglichen also ein tieferes Verständnis der molekularen Grundlagen von GIST.
NMR-spektroskopische und chromatographische Untersuchungen zur Bestimmung des Struktur- und Diffusionsverhaltens von amphiphilen Poly-2-oxazolinen, Homo- und Copolymeren
(2022) Grabe, Bastian; Hiller, Wolf; Weberskirch, Ralf
Die NMR-Spektroskopie, als eine der vielfältigsten Methoden der Analytik, hilft dabei Probleme von chemischem Interesse zu lösen und das Verständnis zu erweitern. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung der chemischen und physikalischen Eigenschaften von Polymeren mittels NMR-Spektroskopie unter Verwendung bekannter Methoden sowie neu entwickelter Applikationen. Besonderer Fokus liegt dabei auf der Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY). Für die Untersuchung von mizellaren Systemen wurden amphiphile Poly-2-oxazolin Block-Copolymere synthetisiert, die in wässriger Lösung Mizellen ausbilden. Es wurden hydrodynamische Radien als auch die Anteile der Mizellen in Lösung unter variablen Bedingungen bestimmt, um so die Abhängigkeit der physikalischen Eigenschaften von der chemischen Struktur zu verstehen. Zudem wurde in dieser Arbeit eine alternative Methode, basierend auf Diffusion Ordered Spectroscopy in Verbindung mit der inversen Laplace Transformation (ILT) entwickelt. werden. Die ermittelten 1H-Signalabfälle des DOSY-Experiments wurden mit Hilfe der ILT in eine Diffusionskoeffizientenverteilung des Polymers überführt. Die neu entwickelte DOSY-ILT Methode konnte erfolgreich an PS-b-PMMA Copolymeren etabliert und mit der chromatographischen Analyse verglichen werden. Für die Auftrennung und Analyse einer Oligostyrolmischung wurde eine neue Kopplung von LC und NMR entwickelt. Die 3D-LC-DOSY Experimente lieferten für die Charakterisierung der Substanzen hydrodynamische Radien, Molmassen sowie die Zusammensetzung der Analyten.
Development of a screening platform for the identification of macrocyclic splicing inhibitors
(2023) Nowacki-Hansen, Jessica; Waldmann, Herbert; Summerer, Daniel
Protein-RNA interactions are substance of research of the last decades and are yet to be fully explored. Interactions of RNA-binding proteins (RBPs) with RNA are found in a plethora of fundamental biological processes such as transcription, splicing, capping, polyadenylation, and translation. Alternative splicing (AS) is the major contributor to the high protein diversity in humans, with only ~30,000 genes present, and is regulated by RBPs such as spliceosomal subunits and alternative splicing factors. Aberrant function and expression of these factors disorganise splicing patterns, which can cause neurodegenerative diseases and cancer. Targeting alternative splicing factors to fight cancer has emerged as a novel promising therapeutic approach. For this purpose, two alternative splicing factors, SRSF1 and hnRNP A2B1, were first explored with the translational repression assay procedure (TRAP) to monitor the proteins’ interaction with RNA. The TRAP assay results delivered relative binding affinities, given in repression ratios, and were found to correlate with absolute binding affinities measured with the fluorescence polarisation (FP) assay. Binding motifs for RBPs are often found by cross-linking or pull-down approaches that are cost-intense and laborious. The work described here presents a novel approach using the TRAP assay in a high throughput format to screen for 10mer RNA consensus sequence for SRSF1 and hnRNP A2B1. The TRAP assay, in combination with the plasmid-encoded peptide library SICLOPPS, was used to screen for hexameric cyclic peptides as inhibitors for the RBPs. In a first approach, Sanger sequencing was used to sequence analysis and hit peptides were evaluated using the TRAP assay. Three hit peptides were synthesized chemically and evaluated by FP. In a second, optimised screening approach, Illumina sequencing was used for hit analysis, and the top six peptides were synthesised and evaluated by FP. Two promising candidate peptides for hnRNP A2B1 were found that are currently being analysed and verified as true inhibitors.

Browse

Recent Submissions