Fakultät für Chemie und Chemische Biologie

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http://hdl.handle.net/2003/39253

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Tunable synthetic hydrogels to study angiogenic sprouting
(2023-08-09) Trapani, Giuseppe; Weiß, Martin Sebastian; Trappmann, Britta
Angiogenic sprouting, the formation of new blood vessels from pre-existing vasculature, is tightly regulated by the properties of the surrounding tissue microenvironment. Although the extracellular matrix has been shown to be a major regulator of this process, it is not clear how individual biochemical and mechanical properties influence endothelial cell sprouting. This information gap is largely due to the lack of suitable in vitro models that recapitulate angiogenic sprouting in a 3D environment with independent control over matrix properties. Here, we present protocols for the preparation of endothelial cell spheroid-laden synthetic, dextran-based hydrogels, which serve as a highly tunable 3D scaffold. The adjustment of the hydrogels’ adhesiveness, stiffness, and degradability is demonstrated in detail. Finally, we describe assays to elucidate how individual matrix properties regulate angiogenic sprouting, including their analysis by immunofluorescence staining and imaging. © 2023 The Authors. Current Protocols published by Wiley Periodicals LLC. Basic Protocol 1: Synthesis of methacrylated dextran (DexMA) Basic Protocol 2: Generation of endothelial cell spheroids in microwells Basic Protocol 3: Endothelial cell sprouting in hydrogels of tunable stiffness Basic Protocol 4: Endothelial cell sprouting in hydrogels of tunable adhesiveness Basic Protocol 5: Endothelial cell sprouting in hydrogels of tunable degradability Basic Protocol 6: Imaging of endothelial cell spheroid-laden hydrogels Support Protocol 1: Preparation of pro-angiogenic cocktail for endothelial cell sprouting
The critical role of oxalate in the liver-kidney axis and its effect on glucose metabolism
(2024) Gabrys, Philipp; Hengstler, Jan G.; Thriel, Christoph van
Glucose metabolism is a highly regulated and conserved pathway orchestrated by several factors like hormones, nutritional state and enzymes. The organs, which are responsible to maintain normal blood glucose levels are the liver the kidney. Under prolonged fasting, the body makes use of the de novo production of glucose from non-carbohydrate substrates – mainly lactate, glycerol and amino acids. This process is called gluconeogenesis. In the non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) hepatic gluconeogenesis is frequently elevated which results in hyperglycemia and manifests the progression to type 2 diabetes mellitus. In a previous study, a steatosis-associated downregulation of the alanine-glyoxylate aminotransferase (Agxt) was observed in mouse models and patients with NAFLD, and this was accompanied by increased urinary oxalate levels. The physiological function of Agxt is to detoxify glyoxylate to prevent the formation of the harmful waste product oxalate. Therefore, decreased Agxt expression in the fatty liver could represent a mechanism that explains a higher risk of hyperoxaluria in patients with NAFLD. In addition to the well-established role of Agxt in preventing oxalate production, evidence for a role of Agxt in amino acid-driven gluconeogenesis exists, which has to date not been completely understood. At the same time, oxalate has been reported to inhibit pyruvate carboxylase, a key enzyme of the gluconeogenesis pathway. Altogether, this leads to the hypothesis, that Agxt may support gluconeogenesis by restricting oxalate generation. To investigate this hypothesis, the inhibitory effect of oxalate on gluconeogenesis was first studied in vitro. The exposure of oxalate and the oxalate precursor hydroxyproline to human and murine hepatocytes in this assay revealed an inhibitory effect of oxalate on the glucose production from pyruvate, lactate and alanine, but not from glycerol. The findings demonstrated a critical role and a direct influence of oxalate on glucose synthesis from precursors that require pyruvate carboxylase to enter the gluconeogenesis pathway.To translate the in vitro findings to an in vivo model, glucose homeostasis was studied in AgxtKO mice, which display high plasma and urinary oxalate levels. The results revealed no changes in the plasma glucose levels, but, intriguingly, a decreased body weight loss after an overnight starvation. In plasma, levels of the glucogenic amino acid glutamine were decreased after fasting in Agxt-deficient compared to wildtype mice. Glucose metabolism-associated gene expression analysis in the liver showed no difference between AgxtKO and wt mice, whereas in the kidney, gene expression changes were observed, suggesting upregulation of compensatory pathways to overcome oxalate inhibition, such as glycerol-driven gluconeogenesis. The results demonstrated that renal gluconeogenesis is more affected by oxalate in the kidney of hyperoxaluric AgxtKO mice, and when hepatic Agxt deficiency appears it affects muscle protein breakdown and glutamine release. This indicates a role of Agxt in gluconeogenesis, since other key enzymes of gluconeogenesis were also upregulated. The results suggest a small contribution of Agxt in glucose homeostasis via regulation of oxalate generation within hepatocytes. In the absence of Agxt, mice can maintain glycemia. However, the levels of oxalate generated in the liver appear to affect the kidney, as judged by the observed gene expression changes. We propose that in kidney, gluconeogenesis from glycerol and other compensatory pathways will be predominant when Agxt is downregulated and oxalate levels become high enough to inhibit gluconeogenesis via pyruvate carboxylase. Conversely, upregulation of Agxt – e.g. by glucagon or pyruvate availability - will prevent oxalate generation and allow pyruvate-driven gluconeogenesis. The hypothesis that levels of oxalate may determine substrate utilization for glucose production in glucose-producing organs like liver and kidney in health and disease should be further explored using 13C metabolic flux analysis. Finally, further experiments are also needed to understand the influence of hepatic Agxt on muscle protein breakdown.
Development of an open-source application for multiprotic small molecule pKa prediction based on machine learning and experimental data
(2024) Baltruschat, Marcel; Czodrowski, Paul; Kast, Stefan M.
Die Säure-Base-Dissoziationskonstante (pKa) und damit der Säure-Base-Charakter eines Moleküls hat einen weitreichenden Einfluss auf seine biopharmazeutischen, pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Eigenschaften. Dazu gehören unter anderem Löslichkeit, Absorption, Permeabilität, Proteinbindung und Lipophilie. Diese weitreichenden Auswirkungen sind der Grund dafür, dass pKa-Werte experimentell bestimmt und im Rahmen des Arzneimittelzulassungsverfahrens angegeben werden müssen. Eine genaue Abschätzung der pKa-Werte ist daher von entscheidender Bedeutung für ein erfolgreiches Wirkstoffdesign. Für die Vorhersage von pKa-Werten für kleine Moleküle existieren mehrere kommerzielle und nichtkommerzielle Tools und Ansätze, jedoch fehlt ein quelloffenes, frei verfügbares pKa-Vorhersagetool, das sich in seiner Vorhersagequalität und seinem Funktionsumfang mit den kommerziellen Tools messen kann. Ziel dieser Arbeit ist es, ein solches Tool zu entwickeln, welches auf maschinellem Lernen und ausschließlich experimentell ermittelten pKa-Daten basiert. Dazu wurden zunächst experimentell ermittelte pKa-Daten durch umfangreiche Literatur- und Datenbankrecherchen sowie durch Kooperationen mit verschiedenen Pharmaunternehmen und Softwareanbietern zusammengetragen und standardisiert. Anschließend wurde mit der Entwicklung eines auf maschinellem Lernen basierenden pKa-Vorhersagetools für monoprotische Moleküle begonnen. Nach der Evaluierung verschiedener Transformationsmethoden vom Molekül zu für das Training verwendbare Eingabedaten sowie verschiedener Machine-Learning-Algorithmen konnte ein Random Forest Modell entwickelt werden, das, auf Basis externer Testdatensätze aus der Literatur und der pharmazeutischen Industrie sowie einer 5-fachen Kreuzva- lidierung, mit dem kommerziellen Tool ChemAxon Marvin mithalten kann sowie die Vorhersagequalität vergleichbarer, zu diesem Zeitpunkt veröffentlichter Open-Source-Modelle übertrifft. Die 5-fache Kreuzvalidierung ergab einen MAE von 0.682, einen RMSE von 1.032 und einen R2 von 0.82. Im nächsten Schritt wurde der Fokus auf multiprotische Moleküle gelegt. Hier musste die Datenaufbereitung und Vorverarbeitung erweitert werden, um die konkreten Fragestellungen der Identifizierung und Lokalisierung von Titrationsstellen in Molekülen sowie die Zuordnung der einzelnen experimentellen pKa-Werte zu ihren jeweiligen titrierbaren Gruppen zu bearbeiten. Zu diesem Zweck wurde das Programm Multiprotic pKa Processor (MPP) entwickelt. MPP führt alle notwendigen Vorverarbeitungsschritte durch, identifiziert und lokalisiert titrierbare Gruppen und führt alle weiteren vorbereitenden Schritte durch, um einen schnellen Start des maschinellen Lernens auf Basis der bearbeiteten Datensätze zu ermöglichen. Zusätzlich wird eine detaillierte Analyse der titrierbaren Gruppen der Moleküle in den gegebenen Datensätzen durchgeführt. MPP liefert auch eine Liste von SMILES Arbitrary Target Specification (SMARTS)-Mustern, die die am häufigsten vorkommenden titrierbaren Gruppen repräsentieren und auf Basis der Eingabedatensätze generiert wurden. Insgesamt wurden 16 Datensätze aus verschiedenen Quellen mit insgesamt 84957 pKa-Werten für 26568 verschiedene Moleküle verarbeitet und für das maschinelle Lernen vorbereitet. Schließlich wurde ein multiprotisches pKa-Vorhersagemodell basierend auf der Graph Convolutional Neural Network (GCN)-Architektur auf der Grundlage der aus MPP resultierenden Datensätze entwickelt. Die Implementierung des GCN sowie die Umwandlung der Moleküle in Graphen und das Hinzufügen von Kanten- und Knoteneigenschaften erfolgte mit PyTorch und PyTorch Geometric. Zur Optimierung der Architektur und der Hyperparameter wurde eine Bayes’sche Optimierung mit 500 Durchläufen mittels Optuna durchgeführt. Die einzelnen Modelle wurden mit externen Testdatensätzen evaluiert und mit MLflow getrackt und dokumentiert. Das beste Modell erreichte über alle titrierbaren Gruppen aller mono-, di- und triprotischen Moleküle für den Literatur-Testdatensatz von Settimo et al. einen MAE von 0.414, einen RMSE von 0.587 und einen R2 von 0.929. Für den Industrie-Testdatensatz von Novartis erreichte das Modell einen MAE von 0.791, einen RMSE von 1.048 und einen R2 von 0.808. Insgesamt liegt der MAE-Wert aller Testdatensätze kombiniert bei 0.748. Im Rahmen einer erweiterten Evaluierung wurde ein zweites Modell mit den gleichen Hyperparametern und einem angepassten Trainingsdatensatz trainiert und mit den SAMPL6 und SAMPL7 Datensätzen als externe Testdatensätze evaluiert. Für den monoprotischen Teil beider Datensätze erreichte das Modell einen MAE von 0.442 bzw. 0.722, einen RMSE von 0.592 bzw. 0.907 und einen R2 von 0.915 bzw. 0.851 für SAMPL6 und SAMPL7. Im Falle von SAMPL6 können die statistischen Werte aufgrund der Filterung im Zuge der Präprozessierung nicht mit den veröffentlichten statistischen Werten verglichen werden.
Dbf4-dependent kinase promotes cell cycle controlled resection of DNA double-strand breaks and repair by homologous recombination
(2024-04-03) Galanti, Lorenzo; Peritore, Martina; Gnügge, Robert; Cannavo, Elda; Heipke, Johannes; Palumbieri, Maria Dilia; Steigenberger, Barbara; Symington, Lorraine S.; Cejka, Petr; Pfander, Boris
DNA double-strand breaks (DSBs) can be repaired by several pathways. In eukaryotes, DSB repair pathway choice occurs at the level of DNA end resection and is controlled by the cell cycle. Upon cell cycle-dependent activation, cyclin-dependent kinases (CDKs) phosphorylate resection proteins and thereby stimulate end resection and repair by homologous recombination (HR). However, inability of CDK phospho-mimetic mutants to bypass this cell cycle regulation, suggests that additional cell cycle regulators may be important. Here, we identify Dbf4-dependent kinase (DDK) as a second major cell cycle regulator of DNA end resection. Using inducible genetic and chemical inhibition of DDK in budding yeast and human cells, we show that end resection and HR require activation by DDK. Mechanistically, DDK phosphorylates at least two resection nucleases in budding yeast: the Mre11 activator Sae2, which promotes resection initiation, as well as the Dna2 nuclease, which promotes resection elongation. Notably, synthetic activation of DDK allows limited resection and HR in G1 cells, suggesting that DDK is a key component of DSB repair pathway selection.
Matrix resistance toward proteolytic cleavage controls contractility‐dependent migration modes during angiogenic sprouting
(2024-03-13) Weiß, Martin S.; Trapani, Giuseppe; Long, Hongyan; Trappmann, Britta
Tissue homeostasis and disease states rely on the formation of new blood vessels through angiogenic sprouting, which is tightly regulated by the properties of the surrounding extracellular matrix. While physical cues, such as matrix stiffness or degradability, have evolved as major regulators of cell function in tissue microenvironments, it remains unknown whether and how physical cues regulate endothelial cell migration during angiogenesis. To investigate this, a biomimetic model of angiogenic sprouting inside a tunable synthetic hydrogel is created. It is shown that endothelial cells sense the resistance of the surrounding matrix toward proteolytic cleavage and respond by adjusting their migration phenotype. The resistance cells encounter is impacted by the number of covalent matrix crosslinks, crosslink degradability, and the proteolytic activity of cells. When matrix resistance is high, cells switch from a collective to an actomyosin contractility-dependent single cellular migration mode. This switch in collectivity is accompanied by a major reorganization of the actin cytoskeleton, where stress fibers are no longer visible, and F-actin aggregates in large punctate clusters. Matrix resistance is identified as a previously unknown regulator of angiogenic sprouting and, thus, provides a mechanism by which the physical properties of the matrix impact cell migration modes through cytoskeletal remodeling.
Structural investigation of the relaxed cardiac sarcomere by electron cryo-tomography
(2024) Tamborrini, Davide; Raunser, Stefan; Dehmelt, Leif
The sarcomere is the basic unit of striated muscles and consists of interdigitating thick and thin filaments. The two types of filaments slide on each other resulting in the shortening of sarcomere itself thereby generating work. The thin filament comprises filamentous actin (F-actin), troponin (Tn), and tropomyosin (Tm). The thick filament is the force bearing part of the sarcomere and it comprises myosin, titin, and myosin-binding protein C (MyBP-C). The vast majority of the mutations responsible for familial hypertrophic cardiomyopathy and other heart and muscle diseases are borne by components of the thick filaments. However, despite its central importance, it remains unclear how thick filaments are structurally organized and how its components interact with each other and with thin filaments to enable highly regulated muscle contraction in the cardiac tissue. In this thesis, I aimed to elucidate the molecular organization of the thick and thin filaments from left ventricular myofibrils in their relaxed state. I resorted to cryo-focused ion beam milling (cryo-FIB- milling) and cryo-electron tomography (cryo-ET) to investigate the molecular architecture of the native mammalian cardiac sarcomeres. The reconstruction of the thick filament provides insight into the three-dimensional arrangement of myosin heads and tails, MyBP-C, and titin. This clarification of structural details sheds light on their interplay during muscle contraction. The positioning of myosin heads exhibits variability based on their location along the filament, indicating diverse capabilities in terms of susceptibility to strain and activation. Meanwhile, the arrangement and interactions of myosin tails follow a distinct pattern, potentially governed by the organization of three alpha and three beta titin chains resembling a spring. This hints at specialized functions of thick filament segments in length-dependent activation (LDA) and contraction. Interestingly, the three titin alpha chains extend throughout the entire length of the thick filament, in contrast to titin beta. The structural analysis further reveals that the C-terminal region of MyBP-C not only binds to myosin tails but also unexpectedly interacts directly with myosin heads. This suggests a hitherto unreported direct involvement in maintaining the myosin OFF state. Furthermore, we visualize how MyBP-C forms links between thin and thick filaments. This study provides a molecular blueprint of the cardiac sarcomere and paves the way to forthcoming research aiming to explore muscle disorders that involve sarcomeric structural components.
β2 adrenergic receptor desensitization through chronic stimulation of Natural Killer cells
(2024) Jürgens, Martin Maria; Watzl, Carsten; Capellino, Silvia
Stress is a ubiquitous phenomenon that impacts the health of populations across all social strata. While acute stress can be beneficial, chronic stress elevates the risk for various diseases. A major part of the body’s stress response operates through the Sympathetic-Adrenal-Medullary (SAM) axis, leading to the release of epinephrine. This stress mediator can impact the immune system and alter the immune defense response. Natural Killer (NK) cells play a critical role in early immune responses, defending against pathogens and malignant cells. During stressful situations, NK cells are recruited to the blood circulation within minutes. The expression of adrenergic receptors, particularly β2 adrenergic receptors (β2AR), renders them sensitive to epinephrine. This study analyzed the response of NK cells to acute and chronic β2AR stimulation. We confirmed that acute β2AR stimulation inhibits NK cell functions in vitro. Epinephrine showed potent inhibitory effects, suppressing the activation of NK cells independent of the activation signal. The β2AR stimulation reduced NK cell adhesion, IFNγ secretion, degranulation, and cytotoxicity. We could show that β2AR stimulation effectively blocked the LFA-1 activity and led to the detachment from its ligand ICAM-1. The effect was rescued through the addition of Propranolol, a beta blocker, or ADRB2 knock out implicating LFA-1 inhibition as critical role for NK cell mobilization. The metabolic analysis revealed that β2AR agonists influenced the metabolic profile upon NK cell activation, leading to a prolonged glycolysis activity displayed by Seahorse ECAR values. In contrast, chronic β2AR stimulation nullified NK cell inhibition. After five days of β2AR treatment, NK cells were no longer responsive to a β2AR agonist. Chronic β2AR stimulation did not alter protein translation but led to receptor phosphorylation through the PKA feedback loop, initiating a G-protein switch and receptor desensitization. The β2AR treatment with long-acting β2 agonist (LABA) Indacaterol and epinephrine displayed different properties. While epinephrine inhibited NK cells only transiently as long as the β2AR agonist was abundant, Indacaterol could not be washed away and continuously stimulated the receptor. For this reason, a single LABA treatment was sufficient to induce NK cell desensitization. However, peripheral NK cells from LABA-treated patients remained responsive to epinephrine. They did not exhibit inhibition but showed an overall correlation in NK cell fitness with asthma severity. Taken together, the transient, inhibitory effect of epinephrine indicate that the hormone plays a crucial role in NK cell recruitment during acute stressful situations while repeated β2AR stimulation leads to desensitization.
Biochemische und strukturbiologische Charakterisierung der Rezeptortyrosinkinasen KIT und PDGFRA
(2024) Teuber, Alina; Rauh, Daniel; Bauer, Sebastian
Die Rezeptortyrosinkinasen KIT und PDGFRA spielen eine essenzielle Rolle in einer Vielzahl von Signaltransduktionskaskaden, welche grundlegende Zellprozesse wie Proliferation und das Überleben der Zelle regulieren. Diese Signalwege werden von Liganden, die an die extrazelluläre Domäne binden, gesteuert, welche wiederum eine Rezeptor-Dimerisierung und intrazelluläre Aktivierung der katalytisch aktiven Kinasedomäne zur Folge haben. KIT und PDGFRA wurden in ~80 % bzw. in ~15 % der auftretenden Fälle von gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) als treibende Onkogene identifiziert, wobei Primärmutationen innerhalb der Rezeptoren eine Abhängigkeit von der entsprechenden Kinase und den nachgeschalteten Signalwegen induzieren. Die auftretenden Mutationen weisen zudem meist einen Liganden-unabhängigen Aktivierungsmechanismus auf, sodass die Kinasedomänen konstitutiv aktiviert vorliegen. GIST sind weitestgehend Chemotherapie- und Strahlentherapie-resistent und stellen deshalb seit Jahrzehnten eine schwer zu behandelnde Krebserkrankung mit schlechter Prognose für die Patienten dar. Seit Anfang der 2000er Jahre wird neben der Chemo- oder Strahlentherapie auch vermehrt die Präzisionsonkologie zur Behandlung von Krebserkrankungen angewendet. Durch die Identifizierung der treibenden Onkogene konnten speziell gegen das jeweilige Onkogen gerichtete Wirkstoffe entwickelt werden. Das Paradebeispiel hierfür stellt Imatinib dar, welches zur Inhibition der Fusionskinase BCR-ABL und somit für die Behandlung chronisch myeloischer Leukämie (CML, engl.: chronic myeloid leukemia) entwickelt wurde. In den darauffolgenden Jahren konnte ebenfalls eine Wirkung von Imatinib bei der Behandlung von GIST nachgewiesen werden. Dieses repurposing von bereits für andere Indikationen zugelassenen Wirkstoffen wurde für die Behandlung von GIST eine immer wichtigere Therapiestrategie, da bis zum Jahre 2020 kein Wirkstoff für die selektive Inhibition von KIT und PDGFRA entwickelt und zugelassen worden war. Eine große Problematik stellen unter anderem auftretende Resistenzmutationen dar, die zur Unwirksamkeit der Inhibitoren beim Patienten führen und somit ein Fortschreiten der Krankheit hervorrufen. Vor dem Hintergrund der klinischen Herausforderungen im Umgang mit GIST, insbesondere aufgrund der Entstehung von Resistenzmutationen gegenüber den zugelassenen Inhibitoren, richtet sich der Fokus dieser Arbeit auf die Evaluierung von niedermolekularen Liganden der relevanten Onkogene KIT und PDGFRA in biochemischen, biophysikalischen und strukturbiologischen Systemen. Hierfür wurden fokussierte Substanzbibliotheken, welche auf unterschiedlichen Grundgerüsten basieren, hinsichtlich ihrer inhibitorischen Potenz gegenüber den Zielproteinen KIT und PDGFRA profiliert und Struktur-Aktivitäts-Beziehungen abgeleitet. Als große Herausforderung stellte sich die Etablierung von Expressions-, Reinigungs- und Kristallisationssystemen für klinisch relevante Mutationen heraus, wobei sich bereits die Expression der Zielproteine als problematisch erwies. Deshalb wurden zusätzlich zu den bereits vorhandenen Konstrukten 19 weitere Genkonstrukte generiert, welche in der Zukunft die erfolgreiche Etablierung der genannten Systeme ermöglichen könnten. Der Großteil der hier generierten Konstrukte befindet sich zum aktuellen Zeitpunkt in einem vorläufigen Stadium und ist Gegenteil aktueller Arbeiten in der Arbeitsgruppe. Weiter wurden die Wildtyp-Proteine und die Türsteher-mutierten Varianten von KIT und PDGFRA erfolgreich heterolog in Bakterien- bzw. Insektenzellen exprimiert und säulenchromatographisch gereinigt. Die Identifizierung eines Cysteins in der backpocket und eines Cysteins in der ATP-Bindetasche der Kinasedomänen führte zur Etablierung einer fokussierten Bibliothek warhead-tragender Inhibitoren. Die gereinigten Proteine konnten somit für die Untersuchung der kovalent-modifizierenden Eigenschaften dieser Liganden in massenspektrometrischen Vermessungen verwendet, sowie für strukturbiologische Untersuchungen mittels Röntgenkristallographie eingesetzt werden. Hierdurch konnten Substanzen identifiziert werden, die nachweislich irreversibel an die Zielproteine KIT-wt und PDGFRA-T674I binden, und somit ein neuartiges Adressierungskonzept der Kinasen etabliert und validiert werden. Durch strukturelle Vergleiche der verschiedenen Inhibitortypen gebunden an ihre Zielproteine konnten Schlussfolgerungen für weitere Struktur-basierte Designstrategien neuer Inhibitoren erarbeitet werden. Initiale strukturbiologische Untersuchungen halfen, unterschiedliche Kinasekonformationen zu identifizieren und zugrundeliegende Aktivierungsmechanismen zu verstehen. Darüber hinaus wurde für den erst 2020 zugelassenen Wirkstoff Avapritinib (Ayvakit®) der detaillierte Bindungsmodus in KIT-wt, KIT-T670I und PDGFRA-T674I aufgeklärt und eine neue Subtasche in den Kinasen identifiziert, welche essenziell für die potente Bindung des Liganden ist. Insgesamt sind 43 Kristallstrukturen entstanden, wovon 32 Strukturen zum aktuellen Zeitpunkt finalisiert wurden. Von diesen finalen Strukturen wurden bereits 21 in der Protein Data Bank (PDB) veröffentlicht bzw. deponiert. Weitere 11 der insgesamt 43 Kristallstrukturen sind Gegenstand aktueller Analysen auf Geheimhaltungsbasis und werden deshalb im Rahmen dieser Arbeit nicht diskutiert. In Kombination mit den erhaltenen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen legten die Kristallstrukturen einen Grundstein für das Design optimierter Liganden zur Adressierung von KIT und PDGFRA im Kontext von GIST. Zusammen mit der Aufklärung von auftretenden Resistenzmutationen können entscheidende Informationen für die Weiterentwicklung von Therapieansätzen erhalten werden. Die im Rahmen dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse ermöglichen also ein tieferes Verständnis der molekularen Grundlagen von GIST.
NMR-spektroskopische und chromatographische Untersuchungen zur Bestimmung des Struktur- und Diffusionsverhaltens von amphiphilen Poly-2-oxazolinen, Homo- und Copolymeren
(2022) Grabe, Bastian; Hiller, Wolf; Weberskirch, Ralf
Die NMR-Spektroskopie, als eine der vielfältigsten Methoden der Analytik, hilft dabei Probleme von chemischem Interesse zu lösen und das Verständnis zu erweitern. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung der chemischen und physikalischen Eigenschaften von Polymeren mittels NMR-Spektroskopie unter Verwendung bekannter Methoden sowie neu entwickelter Applikationen. Besonderer Fokus liegt dabei auf der Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY). Für die Untersuchung von mizellaren Systemen wurden amphiphile Poly-2-oxazolin Block-Copolymere synthetisiert, die in wässriger Lösung Mizellen ausbilden. Es wurden hydrodynamische Radien als auch die Anteile der Mizellen in Lösung unter variablen Bedingungen bestimmt, um so die Abhängigkeit der physikalischen Eigenschaften von der chemischen Struktur zu verstehen. Zudem wurde in dieser Arbeit eine alternative Methode, basierend auf Diffusion Ordered Spectroscopy in Verbindung mit der inversen Laplace Transformation (ILT) entwickelt. werden. Die ermittelten 1H-Signalabfälle des DOSY-Experiments wurden mit Hilfe der ILT in eine Diffusionskoeffizientenverteilung des Polymers überführt. Die neu entwickelte DOSY-ILT Methode konnte erfolgreich an PS-b-PMMA Copolymeren etabliert und mit der chromatographischen Analyse verglichen werden. Für die Auftrennung und Analyse einer Oligostyrolmischung wurde eine neue Kopplung von LC und NMR entwickelt. Die 3D-LC-DOSY Experimente lieferten für die Charakterisierung der Substanzen hydrodynamische Radien, Molmassen sowie die Zusammensetzung der Analyten.
Development of a screening platform for the identification of macrocyclic splicing inhibitors
(2023) Nowacki-Hansen, Jessica; Waldmann, Herbert; Summerer, Daniel
Protein-RNA interactions are substance of research of the last decades and are yet to be fully explored. Interactions of RNA-binding proteins (RBPs) with RNA are found in a plethora of fundamental biological processes such as transcription, splicing, capping, polyadenylation, and translation. Alternative splicing (AS) is the major contributor to the high protein diversity in humans, with only ~30,000 genes present, and is regulated by RBPs such as spliceosomal subunits and alternative splicing factors. Aberrant function and expression of these factors disorganise splicing patterns, which can cause neurodegenerative diseases and cancer. Targeting alternative splicing factors to fight cancer has emerged as a novel promising therapeutic approach. For this purpose, two alternative splicing factors, SRSF1 and hnRNP A2B1, were first explored with the translational repression assay procedure (TRAP) to monitor the proteins’ interaction with RNA. The TRAP assay results delivered relative binding affinities, given in repression ratios, and were found to correlate with absolute binding affinities measured with the fluorescence polarisation (FP) assay. Binding motifs for RBPs are often found by cross-linking or pull-down approaches that are cost-intense and laborious. The work described here presents a novel approach using the TRAP assay in a high throughput format to screen for 10mer RNA consensus sequence for SRSF1 and hnRNP A2B1. The TRAP assay, in combination with the plasmid-encoded peptide library SICLOPPS, was used to screen for hexameric cyclic peptides as inhibitors for the RBPs. In a first approach, Sanger sequencing was used to sequence analysis and hit peptides were evaluated using the TRAP assay. Three hit peptides were synthesized chemically and evaluated by FP. In a second, optimised screening approach, Illumina sequencing was used for hit analysis, and the top six peptides were synthesised and evaluated by FP. Two promising candidate peptides for hnRNP A2B1 were found that are currently being analysed and verified as true inhibitors.
The role of granzymes in natural killer cell cytotoxicity
(2023) Bönnemann, Vivian; Watzl, Carsten; Zimmer, Philipp
Natural killer (NK) cells are innate immune cells that defend the human body against viral infections and tumor growth. NK cells exhibit two pathways to kill aberrant cells: the granule-mediated pathway and the death receptor-mediated pathway. Upon target cell contact, NK cells release granules that contain cytotoxic proteins such as granzymes. Although the main contributor granzyme B (GrzB) of the granule-mediated pathway has been investigated extensively, the role of the other four human granzymes A, H, K and M in NK cell cytotoxicity is less understood. In this thesis, we created fluorescent localization reporters to compare the activity of GrzB to the other four human granzymes within single target cells. The reporters not only visualize whether there is granzyme activity within the target cells, they also provide information about the kinetics. In this study, we observed that NK92 cells mainly kill their targets by using GrzB with partial support of GrzA. If GrzB is knocked out, GrzA acts as the only backup for GrzB and can induce apoptosis on its own. Although the granzymes H, K and M are expressed by all NK cells investigated in this study, they do not play a role for NK92 cytotoxicity, but rather in target cell killing by primary human NK cells. Here, we found different relevance of granzymes for resting (M > A > K > H) and activated (A > M > K > H) primary NK cells. In addition, CD56bright primary NK cells exhibit a higher GrzK content compared to CD56dim NK cells, but even though CD56bright NK cells also release higher levels of GrzK, target cells are still dominantly killed via GrzB. These results therefore further contribute to the understanding of the complexity of NK cell cytotoxicity.
Supplement to Functional improvement of stem cell derived hepatocyte-like cells after targeted FXR gene regulatory network manipulation
(2023-02-15) Feuerborn, David
Functional improvement of stem cell derived hepatocyte-like cells after targeted FXR gene regulatory network manipulation
(2023-02-15) Feuerborn, David; Hengstler, Jan G.; Rahnenführer, Jörg
Primary human hepatocytes (PHH) are important for clinical therapy as well as for studies in pharmacology and toxicology. Hepatocyte-like cells (HLC) derived from pluripotent stem cells offer the perspective of an unlimited supply of PHH, however, genome- and proteome-wide analyses demonstrated that HLC still show major differences compared to PHH. More recently it was shown that, HLC express hepatocyte- and non-hepatocyte-associated genes within the same cells, indicating that HLC reside in a hybrid state that can be targeted by bioinformatics-guided intervention [1]. In this context, it remains to be clarified whether cell line or differentiation protocol-specific differences lead to comparable hybrid states and if the reported hybrid state is a common feature among HLC. In this thesis, HLC obtained by two different protocols from three different induced pluripotent stem cell lines (iPSC) were compared using genome-wide transcriptomics. Furthermore, it was demonstrated that interventions to improve HLC differentiation by targeting the FXR gene regulatory network (GRN) increased the expression of hepatocyte-associated genes and suppressed undesired non-liver genes in HLC, thereby increasing their similarity to PHH. However, this has yet only been shown on the transcriptomic level. Here, functional assays of bile acid secretion and lipid droplet formation were performed to confirm that an FXR targeting intervention strategy does indeed increase the similarity of HLC to PHH.
Inhibition of glucose uptake in NK cells enhances their serial killing capacity
(2022) Picard, Lea Katharina; Watzl, Carsten; Zimmer, Philipp
Glucose-transporter (GLUT)-inhibitors, like Glutor and Glupin, effectively inhibit the proliferation of different tumor cells, making them potential candidates for cancer therapies. Therefore, assessing the impact of GLUT-inhibitors on NK cell function is crucial, as these cells play an important role in anti-tumor response. Seahorse analysis of the energetic phenotype of NK cells treated with Glutor or Glupin showed decreased glycolysis. To further examine the effect of both inhibitors on NK cell effector functions, resting or pre-activated human NK cells were stimulated through CD16 in the presence or absence of Glutor or Glupin. This acute inhibition of the GLUT had no significant effect on NK cell cytotoxicity, cytokine secretion or killing capacity against tumor cells. To analyze possible long-term effects, we cultured freshly isolated NK cells for 3 weeks in the presence or absence of Glutor or Glupin. We could detect a lack of proliferation in case of Glutor-treatment, whereas Glupin-treated NK cells displayed a delayed proliferation. Analysis of various surface receptors showed that long-term treatment with Glutor or Glupin led to an altered NK cell phenotype compared to the control. Furthermore, we examined the cytotoxic and immunoregulatory function of these NK cells: Long-term treatment with Glutor reduced the degranulation and IFN- secretion after stimulation via CD16 or NKp30. Interestingly, Glupin did not affect degranulation in comparison to the control cells, whereas the IFN- secretion was significantly diminished after stimulation via CD16 or NKp30. Furthermore, the serial-killing capacity of long-term treated NK cells with Glupin was higher than that of control cells. Experiments regarding the usage of other fuels, like glutamine or fatty acids, revealed that NK cells did not use fatty acids to fulfil their functions and that glutamine seems to be not responsible for this increased serial killing capacity. RNA-sequencing data together with the analysis of NAD+/NADH concentrations of Glupin-treated NK cells suggests a possible role of CD38 and NAD+ in the serial killing capacity of NK cells. Further, RNA-sequencing of Glutor-treated NK cells displayed a cell cycle arrest, which could explain the lack of proliferation. These data identify Glupin as a suitable candidate for cancer therapy.

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