Identification and characterization of serial killing natural killer cells
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Date
2025
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Human natural killer (NK) cells have been shown to be heterogeneous and differ in their ability to kill target cells. NK cells with the ability to sequentially kill multiple targets are called serial killers. The serial killing activity of NK cells is essential for their cytotoxic function since the majority of kills can be performed by a minority of cells. Consequently, serial killing NK cells are of particular interest for therapeutic applications. However, while it is known that only a fraction of NK cells perform serial killing, it is currently not possible to predict which NK cells will engage in serial killing. Additionally, current methods to identify serial killing NK cells rely mostly on low throughput, time consuming microscopy or micro-fluidic setups which makes it hard to integrate them into a normal workflow.
To investigate serial killing NK cells, we established a staining protocol that can differentiate between the timing and the count of multiple NK cell degranulation events occurring during target cell co-culture. NK cells are analyzed via flow cytometry which enables us to combine degranulation data with other phenotypic readouts. Our method can reproducibly identify donors with high proportions of serial degranulating NK cells. Multiple degranulation events were paralleled by a stepwise loss of granzyme B and perforin. Loss of CD16 was associated with the number of degranulation events, whereas the upregulation of CD69 correlated with the timing of degranulation. Isolating multiple, single and not degranulated NK cells and rechallenging them resulted in the same pattern emerging. Education influenced the performance of NK cells in the serial degranulation assay with educated NK cells outperforming uneducated ones. RNAseq analysis of sorted NK cells that degranulated multiple times compared to ones that did not degranulate identified several differentially expressed genes. However, most of these genes were activation induced and therefore they cannot be used to identify serial killers beforehand. Investigation of a selection of NK cell receptors did also not result in a clear marker for serial killing NK cells. Still, enrichment could be seen for the receptor NKG2A which is involved in education. When sorting NK cells for expression of that receptor the sorted cells reflected the prediction. Overall, our data support a stochastic model of serial killing compared to a predetermined one and offers a method that can be easily picked up and adapted by other research groups.
Humane natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind heterogen und unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit Ziel-Zellen abzutöten. NK-Zellen die in der Lage sind sequenziell mehrere Ziel-Zellen zu töten werden als „serial killer“ bezeichnet. Dieses serielle Töten ist ausschlaggebend für die Zytotoxizität der NK-Zellen da eine Minderheit der Zellen für den Großteil des Effektes sorgen kann. Daher sind „serial kiling“ NK-Zellen von besonderem Interesse für therapeutische Anwendungen. Es ist zwar bekannt, dass nur ein Teil der NK-Zellen dieses Verhalten aufweist, aber es ist nicht möglich vorherzusagen welche. Zusätzlich lässt sich die Analyse von „serial killing“ nur schwer in einen normalen Arbeitsablauf einarbeiten, da sie meist auf zeitraubender Mikroskopie mit geringem Durchsatz oder spezialisierter Mikrofluidik beruht. Um seriell tötende NK-Zellen zu analysieren haben wir eine Färbemethode entwickelt, die es ermöglicht die zeitliche Verteilung und Anzahl mehrerer Degranulations-Events von NK-Zellen in Co-Kultur mit Zielzellen zu messen. Die Durchflusszytometrie-basierte Methode ermöglicht es Degranulations-Messungen mit Phänotyp-Messungen zu verbinden. Unsere Methode kann reproduzierbar Spender mit einem hohen Anteil an „serial killing“ NK-Zellen identifizieren. Vermehrte Degranulation geht einher mit einem schrittweisen Verlust von Granzym B und Perforin. Der Verlust von Oberflächen-CD16 steht in Verbindung mit der Anzahl der Degranulationen und die Hochregulierung von CD69 korreliert mit dem Zeitpunkt der Degranulation. Isolierte mehrfach-, einfach- oder nicht-degranulierte NK-Zellen zeigen ein entsprechendes Verhalten bei erneutem Zielzellenkontakt. NK-Zell „education“ beeinflusst, wie sich die NK-Zellen im Versuch verhalten, „educated“ NK-Zellen sind aktiver als nicht „educated“ NK-Zellen. RNA-Sequenz-Analyse von mehrfach degranulierten und nicht degranulierten NK-Zellen zeigt mehrere differenziell exprimierte Gene. Die meisten von ihnen sind allerdings durch die Aktivierung induziert worden und daher nicht nutzbar um „serial killing“ NK-Zellen im Vorhinein zu identifizieren. Auch die Analyse von ausgewählten NK-Zell-Rezeptoren brachte kein Erkennungsmerkmal hervor. Dennoch ist für Rezeptoren wie NKG2A, welcher in der NK-Zell „education“ eine Rolle spielt, eine Anreicherung zu beobachten. NK-Zellen die entsprechend der Expression dieses Rezeptors sortiert wurden spiegeln das erwartete Degranulations-Muster wider. Insgesamt sprechen unsere Daten eher für ein stochastisches Modell des „serial killing“ als für ein vorherbestimmendes. Die verwendete Methode kann leicht von anderen Forschungsgruppen genutzt und angepasst werden.
Humane natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind heterogen und unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit Ziel-Zellen abzutöten. NK-Zellen die in der Lage sind sequenziell mehrere Ziel-Zellen zu töten werden als „serial killer“ bezeichnet. Dieses serielle Töten ist ausschlaggebend für die Zytotoxizität der NK-Zellen da eine Minderheit der Zellen für den Großteil des Effektes sorgen kann. Daher sind „serial kiling“ NK-Zellen von besonderem Interesse für therapeutische Anwendungen. Es ist zwar bekannt, dass nur ein Teil der NK-Zellen dieses Verhalten aufweist, aber es ist nicht möglich vorherzusagen welche. Zusätzlich lässt sich die Analyse von „serial killing“ nur schwer in einen normalen Arbeitsablauf einarbeiten, da sie meist auf zeitraubender Mikroskopie mit geringem Durchsatz oder spezialisierter Mikrofluidik beruht. Um seriell tötende NK-Zellen zu analysieren haben wir eine Färbemethode entwickelt, die es ermöglicht die zeitliche Verteilung und Anzahl mehrerer Degranulations-Events von NK-Zellen in Co-Kultur mit Zielzellen zu messen. Die Durchflusszytometrie-basierte Methode ermöglicht es Degranulations-Messungen mit Phänotyp-Messungen zu verbinden. Unsere Methode kann reproduzierbar Spender mit einem hohen Anteil an „serial killing“ NK-Zellen identifizieren. Vermehrte Degranulation geht einher mit einem schrittweisen Verlust von Granzym B und Perforin. Der Verlust von Oberflächen-CD16 steht in Verbindung mit der Anzahl der Degranulationen und die Hochregulierung von CD69 korreliert mit dem Zeitpunkt der Degranulation. Isolierte mehrfach-, einfach- oder nicht-degranulierte NK-Zellen zeigen ein entsprechendes Verhalten bei erneutem Zielzellenkontakt. NK-Zell „education“ beeinflusst, wie sich die NK-Zellen im Versuch verhalten, „educated“ NK-Zellen sind aktiver als nicht „educated“ NK-Zellen. RNA-Sequenz-Analyse von mehrfach degranulierten und nicht degranulierten NK-Zellen zeigt mehrere differenziell exprimierte Gene. Die meisten von ihnen sind allerdings durch die Aktivierung induziert worden und daher nicht nutzbar um „serial killing“ NK-Zellen im Vorhinein zu identifizieren. Auch die Analyse von ausgewählten NK-Zell-Rezeptoren brachte kein Erkennungsmerkmal hervor. Dennoch ist für Rezeptoren wie NKG2A, welcher in der NK-Zell „education“ eine Rolle spielt, eine Anreicherung zu beobachten. NK-Zellen die entsprechend der Expression dieses Rezeptors sortiert wurden spiegeln das erwartete Degranulations-Muster wider. Insgesamt sprechen unsere Daten eher für ein stochastisches Modell des „serial killing“ als für ein vorherbestimmendes. Die verwendete Methode kann leicht von anderen Forschungsgruppen genutzt und angepasst werden.
Description
Table of contents
Keywords
Natural killer cells, Serial killing, Degranulation, Flow cytometry
Subjects based on RSWK
Killerzelle