Der direkte Blick auf die Magnetosomen-Kette: PEEM- und SEM-Untersuchungen am intakten Magnetospirillum magnetotacticum
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Date
2015
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In dieser Arbeit wurden magnetotaktische Bakterien der Spezies M. magnetotacticum
mittels PEEM und SEM-EDX untersucht. Diese Bakterien zählen zu den interdisziplinär
interessantesten Mikroorganismen. Aktuelle und potentielle zukünftige Anwendungen
finden sie neben der Geologie, Astrobiologie und Paleomagnetik vor allen in der Nanorobotik,
der Medizintechnik und anderen Biowissenschaften. Hierbei ist ein Verständnis
ihrer Magnetosomenstruktur und ihres Magnetsinnes von außerordentlicher Wichtigkeit.
Ziel dieser Arbeit war es daher Methoden zu entwickeln, mit denen sich diese
Bakterien relativ schnell und einfach präparieren lassen, um das extrem schwierige
Kultivieren der Bakterien zu umgehen. Gleichzeitig muss diese Methode Proben liefern,
die sich durch ihre Oberflchenbeschaffenheit für mikroskopische Untersuchungen
mit elektronenoptischer Bildgebung eignen. Mit diesen Proben wurden PEEM- und
SEM-EDX-Untersuchungen durchgeführt um die Magnetosomen-Ketten im Inneren
der Bakterien abzubilden und auf ihre chemische wie magnetische Struktur hin zu
untersuchen.
Auf dem Weg hierzu wurde eine neue Software entwickelt, die im Vergleich mit dem
bisherigen Vorgehen eine ffektivere wie auch effzientere Durchführung der PEEM-Experimente
ermöglicht. So wird die Anzahl der manuell durchzuführenden Arbeitsschritte
am Experiment und der Strahllinie deutlich reduziert. Die Undulator-Lücke
und die Position der Monochromatorelemente erfolgt hiermit ebenso vollautomatisch
wie die Aufnahme der einzelnen PEEM-Bilder und des zugehörigen Photonenflusses.
Dies reduziert die Fehleranfälligkeit deutlich und ermöglicht gleichzeitig eine schnellere
Durchführung der Messungen.
Im Zuge der Entwicklung einer geeigneten Probenpräparation wurde zunächst das
natürlich Verhalten der Bakterien ausgenutzt. So reichert sich M. magnetotacticum
selbstständig durch die Magneto-Aerotaxis in der OATZ an. Allein hiermit lässt sich
jedoch noch keine geeignete Probe präparieren. Wie hier gezeigt sind die Bakterien noch
von zu vielen Nährmediumsrückständen umgeben. Eine Reduktion dieser Rückstände konnte mittels eine Reihe von Waschprozeduren erzielt werden, die aus wiederholtem
Zentrifugieren, Dekantieren und Resuspendieren bestehen. Als Nebenprodukt der Reduzierung
der Nährmediumsrückstände treten hiernach vermehrt Salzreste auf der
Probenoberfläche auf. Diese erschweren die Abbildung der Bakterien, da sie eng von
den Salzresten umgeben sind und teils verdeckt werden. Eine Abbildung der M. magnetotacticum
gelang in diesem Stadium nur mittels einer Goldbeschichtung der gesamten
Probenoberfläche. Beschichtungen dieser Art sind jedoch nicht wünnschenswert, da sie
eine nähere Untersuchung des Bakterieninneren verhindern. Aus diesem Grunde wurden
mehrere Nachbehandlungen der gewaschenen Bakterienlösung getestet, mit dem Ziel
diese Salzreste zu minimieren. Aus den in dieser Arbeit vorgestellten Behandlungen
hat sich eine Kombination aus Verdünnung der Bakterienlösung mit anschließendem
Abschwemmen der getrockneten Probenoberfläche als geeignetste Methode ergeben.
So ließ sich eine hohe Dichte an freiliegenden Bakterien, bei gleichzeitiger Reduktion
der verbleibenden Salzreste erzielen. Hierüber hinaus wurde zusätzlich eine alternative
Methode entwickelt. Diese liefert Proben mit einer vergleichbaren Oberflächenbeschaffenheit
zur oben beschriebenen Methode. Dabei kommt sie weitgehend ohne zusätzliche
weitere Arbeitsschritte wie das Zentrifugieren aus. Der reduzierte Aufwand wirkt sich
dabei zu Ungunsten der Bakteriendichte aus. Trotzdem liefert diese Alternative Proben
mit einer höheren Bakteriendichte, als dieser Arbeit vorangegangene Präparationen. Anknüpfend an die ersten Abbildung des M. magnetotacticum mittels PEEM erfolgten weitere Untersuchungen an diesen Bakterien, präpariert nach den hier entwickelten Methoden. Da die Ortsauflösung in der Hochenergie-Emission verglichen mit der Schwellenwert-Emission geringer ist, wurde zunächst untersucht, wie sich die Bakterien in PEEM-Aufnahmen identifizieren lassen. Hierzu wurden mittels PEEM-Aufnahmen in Schwellenwert-Emission sowie mittels lichtmikroskopischer Aufnahmen Kriterien
zur Identifizierbarkeit und Verwendbarkeit der Bakterien für weitere Untersuchungen
aufgestellt. Unter Verwendung dieser Kriterien ließen sich nun erstmals auch Messungen
an M. magnetotacticum in Hochenergie-Emission durchführen. Aus PEEM-XAS
Aufnahmen und den hieraus extrahierten Spektren an der Eisen-Kante ließ sich dabei
die Zugänglichkeit der Magnetosomen-Ketten in den MTB mittels PEEM eindeutig
nachweisen. Obwohl die Magnetosomen lediglich einen kleinen Bruchteil der Bakterien
ausmachen, ist deren Eisen-Signal eindeutig erkennbar. Mittels zirkular polarisiertem
Licht konnte darüber hinaus sogar auf die magnetische Struktur der Magnetosomen-
Kette zugegriffen werden. Anhand des Vergleiches mit theoretischen Berechnungen
beider Magnetit-Untergitter gelang es ferner Rückschlüsse auf die magnetische Orientierung der einzelnen Magnetosomen in der Kette zu treffen. Demnach liegen die einzelnen
Magnetosomen in der Magnetosomen-Kette in einer ferromagnetischen Anordnung vor.
Komplementär zu den PEEM-Untersuchungen wurden die M. magnetotacticum-Proben
ebenfalls mittels SEM und SEM-EDX untersucht. Bis zum Zeitpunkt dieser Arbeit gab
es dabei lediglich indirekte Nachweise der Magnetosomen-Kette mittels SEM. In
dieser Arbeit gelang es erstmals Partikelketten mittels SEM direkt innerhalb intakter
MTB zu beobachten. Die weiteren Untersuchungen dieser Strukturen ergab dabei den
Nachweis, dass es sich bei diesen um die Magnetosomen-Ketten der Bakterien handelt.
Die erzielbare Auflösung erlaubt es dabei einzelne Magnetosomen innerhalb der Kette
abzubilden. Mittels dieser Methodik lassen sich relativ schnell Informationen wie die
Größe und Form der einzelnen Magnetosomen und die Länge der Magnetosomen-Kette
gewinnen. Ohne die Magnetosomen extrahieren zu müssen, konnte so eine Analyse
ihrer speziestypischen Charakteristika erfolgen. Die Ergebnisse ergaben dabei eine
sehr gute Übereinstimmung mit vorherigen Analysen. Zudem konnte so auch
die typische Anzahl an Magnetosomen pro Individuum betrachtet werden. Hierbei
handelt es sich um eine Größe, die bei der Analyse extrahierter Magnetosomen nicht
zugänglich ist. Mittels der SEM-EDX-Untersuchungen konnte bestätigt werden, dass
es sich bei den Partikelketten in den SEM-Bildern eindeutig um die eisenhaltigen
Magnetosomen handelt. Auch die chemischen Unterschiede, zwischen dem Bereich der
Magnetosomen-Kette und dem Referenzbereiche, ließen sich durch das unterschiedliche
Signalverhalten entlang der Magnetosomen-Kette klären. Hierdurch konnte ebenfalls
auf die Komposition der Magnetosomen aus Magnetit geschlossen werden.
Die in dieser Arbeit beschriebene Methodik erlaubt es demnach mittels SEM und
einer präparierten Probe mehrere Aspekte eines MTB zu analysieren. Diese reichen
von Form und Struktur des Bakteriums, der Kette und der einzelnen Magnetosomen
bis hin zur chemischen Zusammensetzung. Die Untersuchungen haben dabei gezeigt,
dass ein Einblick in intakte Bakterien sowohl mittels PEEM als auch SEM möglich ist.
Besonders für die Untersuchung neu entdeckter MTB-Spezies ist dies von Bedeutung.
So sind bislang mehrere unterschiedliche Präparate erforderlich um an diese Information
zu gelangen. Ein Kultivieren der Bakterien ist demnach nahezu unumgänglich, was
sich für die meisten Spezies als äußerst schwierig erwiesen hat. Folglich ging der
Erkenntnisgewinn in diesem Feld zeitweise schleppend vonstatten. Hier ist es nun
möglich mit der selben Probe an diese Informationen zu gelangen und im Anschluss sogar
PEEM-Messungen durchzuführen um die magnetischen Eigenschaften der Bakterien zu
ergründen. Nachdem in dieser Arbeit die wichtigen und grundlegenden Techniken sowohl entwickelt
als auch demonstriert wurden und ein Einblick in die magnetische Struktur der
Magnetosomen-Kette des M. magnetotacticum gelang, gilt es in folgenden Arbeiten
diese auf die Breite der unterschiedlichen MTB-Spezies zu übertragen. So ist bereits
bekannt, dass die Form und Größe der Magnetosomen charakteristisch für einzelne
Spezies ist. Eine Untersuchung der Anzahl der Magnetosomen pro Kette verschiedener
Spezies würde Aufschluss geben, ob es sich hier ebenfalls um eine derartige Charakteristik
handelt. Ebenso wäre eine Weiterentwicklung der PEEM-Systeme hin zu einer besseren maximal erzielbaren Ortsauflösung wünschenswert. Hiermit ließen sich in Zukunft einzelne Magnetosomen individuell und im Zusammenspiel mit den andern Magnetosomen der Kette untersuchen.
Description
Table of contents
Keywords
PEEM, SEM, SEM-EDX, MTB, Photoemission, UHV-Präparation, intakte Bakterien, MCD, Synchrotronstrahlung, Magnetismus, Strukturabbildung
Subjects based on RSWK
Magnetosom, Photoemissionselektronenmikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie, Synchrotronstrahlung, magnetischer Sinn