Lehrstuhl Biotechnologie
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Item Analytik intrazellulärer Reaktionsprodukte antitumoraler Platinkomplexe(2017) Zabel, Robert; Sickmann, Albert; Jaehde, UlrichPlatinhaltige Zytostatika, wie z. B. Cisplatin, werden in vivo durch eine Reihe von (bio-) chemischen Reaktionen verändert und metabolisiert. Die wichtigsten Prozesse dabei sind die intrazelluläre Hydrolyse und die Reaktion mit kleineren Nukleophilen oder Proteinen. Bezüglich des Verhaltens von Platinkomplexen im Cytosol sind einige Fragen weiterhin nur unbefriedigend geklärt, insbesondere hinsichtlich der Art und Bedeutung von Addukten des Platins mit intrazellulären Bindungspartnern. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe des fluoreszierenden Cisplatinanalogons CFDA-Pt-Cl2 das Verhalten von Platinkomplexen im niedermolekularen Bereich des Cytosols einer Cisplatin-sensitiven und einer Cisplatin-resistenten Krebszelllinie untersucht. Die hierfür entwickelten und optimierten kapillarelektrophoretischen Trennmethoden erlauben es, niedermolekulare Platinspezies durch die Detektion der Fluoreszenz (CE-LIF) mit kurzen Analysenzeiten (unter fünf Minuten) empfindlich (pmol/L) und reproduzierbar nachzuweisen und zu quantifizieren und mittels Massenspektrometrie (CE-MS) zu identifizieren. Durch Kontroll- bzw. Modellversuche wurde die Reinheit des verwendeten CFDA-Pt-Cl2 sowie die Stabilität und Integrität der Zellkulturproben sichergestellt, die gesamte Probenvorbereitung optimiert und aufgezeigt, dass CFDA-Pt-Cl2 vergleichbare Komplexe, u.a. mit Glutathion, Cystein, Methionin, bildet wie Cisplatin. Die Behandlung von Zellen beider Zelllinien mit CFDA-Pt-Cl2 zeigte, dass der Dichlorokomplex die dominierende Platinspezies (über 70 %) in der niedermolekularen Fraktion des Cytosols ist. Eine Metabolisierung bzw. Hydrolyse des Dichlorokomplexes war nur teilweise und für beide Zelllinien in vergleichbarer Art und Weise zu beobachten. Unterschiede zwischen der Cisplatin-sensitiven und der Cisplatin-resistenten Krebszelllinie konnte bezüglich des Gehaltes an Platinspezies beobachtet werden. Bei Normierung auf den Proteingehalt konnte in den sensitiven Zellen ein höherer Gehalt an Platinspezies in der niedermolekularen Fraktion des Cytosols nachgewiesen werden als in den Zellen der resistenten Zelllinie.Item Selective redox biocatalysis in multiphasic enzyme reactors(2014) Tomaszewski, Bartłomiej; Schmid, Andreas; Kockmann, NorbertReactions catalysed by oxidoreductases are indispensable for chemical synthesis. However, despite obvious advantages like mild reaction conditions and regio-, chemo-, and stereoselectivity, which simplifies product work-up, their implementation in the chemical industry is lacking. Therefore, an integrated approach involving catalyst and reaction engineering and proper reactor design is necessary for commercialising oxidoreductases for organic synthesis. Rational reaction design linking kinetic characterisation of the oxidoreductase and reaction optimisation formed the basis for this thesis. The overall aim of this PhD project was the application of 2-hydroxybiphenyl 3-monooxygenase (HbpA), for preparative scale synthesis of 3-phenylcatechol with an acceptable space time yield (STY). The key challenges limiting the biocatalytic process, namely biocatalyst operational stability, supply of the hydrophobic substrate, oxygen delivery, cofactor regeneration and mass transfer were identified and addressed. Formate dehydrogenase, FDH, was used for continuous NADH regeneration. Addition of the surfactant Tween 20 stabilised the enzymes in the presence of the organic solvent and allowed to recover 100% of the respective enzymatic activity opening the door for application of the biocatalysts in an aqueous/organic two-liquid phase segmented flow microreactor. A biphasic reaction system allowed high substrate loadings whereas the microreactor ensured excellent mass transfer rates between organic and aqueous phases. Finally, using a Teflon AF-2400 membrane in a tube-in-tube fashion allowed for radial delivery of oxygen and improved oxygen availability with respect to one point oxygen delivery in an aqueous/organic/air three phase segmented flow microreactor. Thereby a successful preparative scale biotransformation reaction in a segmented flow tube-in-tube reactor was possible yielding 740 mg of product purified by chromatography and subsequent sublimation. The STY of 14.5 g L total-1 h-1 reached is the highest reported for this enzyme. It is 38 times higher as compared to the batch reactions described earlier (Lutz et al. 2002). Oxygen transfer rates through Teflon AF-2400 membrane were as high as 24 mM min-1 i.e. 16 times higher than in traditional biotechnological processes in stirred-tank reactors. The presented reactor is a promising tool for oxygen dependent biocatalytic reactions in microreactors, and may be regarded as a basis for applications in gram scale organic biosyntheses. Furthermore, it may become a platform for other gas dependent reactions since it extends the operational boundaries beyond the scope of available reactors with respect to aqueous/organic mass transfer and gas transfer rates.