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Item Application of the PAMONO-sensor for quantification of microvesicles and determination of nano-particle size distribution(2017-01-27) Shpacovitch, Victoria; Sidorenko, Irina; Lenssen, Jan Eric; Temchura, Vladimir; Weichert, Frank; Müller, Heinrich; Überla, Klaus; Zybin, Alexander; Schramm, Alexander; Hergenröder, RolandThe PAMONO-sensor (plasmon assisted microscopy of nano-objects) demonstrated an ability to detect and quantify individual viruses and virus-like particles. However, another group of biological vesicles—microvesicles (100–1000 nm)—also attracts growing interest as biomarkers of different pathologies and needs development of novel techniques for characterization. This work shows the applicability of a PAMONO-sensor for selective detection of microvesicles in aquatic samples. The sensor permits comparison of relative concentrations of microvesicles between samples. We also study a possibility of repeated use of a sensor chip after elution of the microvesicle capturing layer. Moreover, we improve the detection features of the PAMONO-sensor. The detection process utilizes novel machine learning techniques on the sensor image data to estimate particle size distributions of nano-particles in polydisperse samples. Altogether, our findings expand analytical features and the application field of the PAMONO-sensor. They can also serve for a maturation of diagnostic tools based on the PAMONO-sensor platform.Item HR-MAS NMR based quantitative metabolomics in breast cancer(2019-01-22) Gogiashvili, Mikheil; Nowacki, Jessica; Hergenröder, Roland; Hengstler, Jan G.; Lambert, Jörg; Edlund, KarolinaHigh resolution magic-angle spinning (HR-MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is increasingly used for profiling of breast cancer tissue, delivering quantitative information for approximately 40 metabolites. One unique advantage of the method is that it can be used to analyse intact tissue, thereby requiring only minimal sample preparation. Importantly, since the method is non-destructive, it allows further investigations of the same specimen using for instance transcriptomics. Here, we discuss technical aspects critical for a successful analysis—including sample handling, measurement conditions, pulse sequences for one- and two dimensional analysis, and quantification methods—and summarize available studies, with a focus on significant associations of metabolite levels with clinically relevant parameters.Item Eine schalt- und verstimmbare dielektrisch behinderte Entladung als weiche Ionisierungsquelle für die Analytik(2018) Schütz, Alexander; Franzke, Joachim; Bayer, ManfredDiese Arbeit zeigt den gezielten Einsatz einer schalt- und verstimmbaren DBD zur weichen Ionisierung für die analytische Chemie. Dafür wurde sie mit der Gaschromatographie, der Flüssigkeitschromatographie und der Laser Desorption gekoppelt. Ergänzend zu den Kurzzusammenfassungen der einzelnen Kapitel, soll diese Zusammenfassung die Verknüpfung der einzelnen Teile untereinander nochmals aufgreifen. Die Detektion der Perfluorcarbonen mittels DBDI-MS hat gezeigt, dass sich die vermutlich toxische Substanzen ohne weitere Probenvorbereitung im negativen Modus des MS messen lassen. Durch die Kopplung einer GC mit einem DBDI-MS Experiment steht nun ein System zur Verfügung, das den Ansprüchen für eine analytische Technik genügt. Aktuelle Publikationen, die das Thema der PFC erneut aufgreifen, zeugen von dem hohen Stellenwert dieser Möglichkeit. Aus physikalischer Sicht wurde das erste Mal eine Ortsabhängigkeit der Probenzufuhr identifiziert und untersucht. Daraus lässt sich bereits erkennen, dass das Plasma auf verschiedene Analyten eine unterschiedliche Wirkung haben kann. Dieser Punkt wird detailliert im Kapitel über die Optimierung der weichen Ionisierungseffizienz für die Massenspektrometrie aufgegriffen. Durch zeitaufgelöste optische Emissionsspektroskopie war es möglich, das Plasma der DBD in verschiedene Komponenten aufzuteilen. Durch weiterführende Experimente konnte gezeigt werden, dass diese einzelnen Plasmen unterschiedliche Wirkungen haben können. Mit Hilfe der gezielten Ansteuerbarkeit konnte ein analytisches Verfahren entwickelt werden, um die Ionisierungseffizienz entsprechend anzupassen. Dadurch erhält man die Möglichkeit mit ein und der selben Entladungsgeometrie sowohl weiche Ionisierung für die Massenspektrometrie oder OES durchzuführen, für die die Analyten ionisiert, dissoziiert und angeregt werden müssen. Die Untersuchungen an einer Helium DBD haben den Entladungsmechanismus verständlich gemacht, der durch eine Transferleistung auf ein analoges System übertragen werden konnte. Während bei einem Helium Plasma der Stickstoff aus der Umgebungsluft eine tragende Rolle spielt, kann ein Argon-Propan Gasgemisch verwendet werden, um einen analogen Effekt erneut auszunutzen. Es wurde gezeigt, dass sich dadurch die Zündspannung drastisch reduzieren lässt. Für die Massenspektrometrie wurdeauf die Technik des Unterdrückens des dissoziativen coincident plasma zurückgreifen, mit Hilfe derer man die Bildung von CH-Clustern unterdrücken kann. Für einen Vergleich wurde diese neue weiche Ionisierungsquelle mit gängigen Techniken wie der APCI, ESI und der etablierten Helium DBD verglichen. Es stellt sich heraus, dass eine optimierte Argon-Propan DBDI eine gute Alternative darstellt und neue Vorteile bieten kann. Die Verwendung eines geschlossenen Systems basierend auf der Argon-Propan DBDI wird im letzten Kapitel verwendet, um die Laser Desorption mit der DBDI-MS zu koppeln. Dadurch wird eine hoch effektive Einkopplung bei Verminderung störender Hintergrundsignale und Erhöhung der Signalintensitäten gewährleistet. In Hinblick auf den Einsatz der DBD im Bereich der medizinischen Forschung wird die Laser Desorption in Zukunft auch für biologische Proben eingesetzt werden. Zusätzlich kann das System so erweitert werden, dass auch die Raman-Spektroskopie integriert werden kann. Somit ergänztz sich die nicht-invasive Raman-Spektroskopie mit der hochsensiblen Massenspektrometrie. Es ist davon auszugehen, dass die DBD auch weiterhin ein wichtiger Bestandteil der analytischen Chemie bleibt. Ihre vergleichsweise einfache Bauweise, Robustheit und Effizienz ermöglicht bereits den kommerziellen Einsatz der DBD auf verschiedene Art und Weise. Vor allem die medizinische Anwendung der DBD macht weitere wissenschaftliche Untersuchungen notwendig. Schon heute wird sie zur Behandlung von Wunden eingesetzt.Item Synthesis of glycopeptides for exploration of mucin‐type‐threonine and HexNAc‐tyrosine modifications(2018) Schorlemer, Manuel; Waldmann, Herbert; Westerlind, UlrikaDie Protein O-Glykosylierung ist eine biologisch sowie strukturell vielseitige Modifikation. Die mucinartige O-Glykosylierung an extrazellulären Mucinproteinen ist z.B. involviert in Zell-Zell- sowie Zell-Matrix- Interaktionen und spielt eine Schlüsselrolle bei Atemwegsinfektionen von COPD-, Mukoviszidose- und Asthmapatienten. Dabei dienen die O-Glykane als Rezeptoren für Virulenzfaktoren von atemwegserkrankungsrelevanten Pathogenen (Bakterien und Viren). Einblicke in die molekularen Details der Bindungsspezifitäten von Virulenzfaktoren wie Adhäsionsproteine (Lektine) oder Sialidasen würde die Entwicklung von glykomimetischen Antiadhäsionsmedikamenten und Enzyminhibitoren zur Infektionsbekämpfung unterstützen. Zudem wurde gezeigt, dass Adenokarzinomzellen (von z.B. Brust-, Darm-, Lungen- und Gebärmutterkrebs) veränderte Mucinglykosylierung sowie -expression aufweisen, was wiederum mit Tumorwachstum und Metastasierung in Verbindung gebracht wird. MUC1-basierte Vakzinkonstrukte gelten als vielversprechend, um eine tumorgerichtete Immunantwort zu induzieren, welche die Tumorlast schließlich beseitigen könnte. Ohne eine Bibliothek bestehend aus MUC1- Gklykopeptiden definierter Struktur jedoch, ist eine Qualitätskontrolle sowie eine präzise Aufklärung der induzierten Antikörper nicht möglich. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Synthese einer wohldefinierten Peptidbibliothek (mit verlängerter Core 2- und Core 4-Glykosylierung) zur Anwendung in Microarrayexperimenten um schließlich Lektin/Glykopeptid- und Antikörper/Glykopeptidspezifitäten aufzuklären. Die so gewonnenen Informationen werden dabei helfen, die oben genannten Herausforderungen bzgl. Atemwegserkrankungs- und Krebsverlauf lösen. Darüber hinaus trug diese Arbeit zu Entwicklung einer neuen oxoniumionenbasierten, massenspektrometrischen Methode zur verbesserten Charakterisierung von Glykopeptidstrukturen bei. O-Glykosyierung wird üblicherweise auf Serin (Ser) oder Threonin (Thr) gefunden, jedoch zeigten jüngste Identifikationen, dass ähnliche Modifikationen auch auf Tyrosin (Tyr) stattfinden können. Diese Modifikationen werden durch Einführung einer HexNAc (GalNAc oder GlcNAc)-Gruppe an die jeweilige Aminosäure initiiert. Eine große Herausforderung war es bei den kürzlich entdeckten HexNAc-Tyrosin- Modifikationen zwischen den strukturell ähnlichen Isomeren αGalNAc-, αGlcNAc- und βGlcNAc-Tyr zu unterscheiden. Eine Zuordnung der Glykanstrukturen war nur möglich durch das generelle Wissen um Biosynthesewege oder beruhend auf bekannten Lektin/Glykan-Bindungspräferenzen zur Lektinaffinitätsanreicherung von Glykopeptidfragmenten. Jedoch sind die Lektinbindungspräferenzen ggü. HexNAc-Tyr bislang unerforscht. Zudem sind Lektine nicht immer in der Lage zwischen verschiedenen Glykanisomeren zu unterscheiden. In bisherigen Studien zum Glykoproteom wurde komplexe Tyr- Glykosylierung als mucinartige αGalNAc-Tyr-Modifikation betrachtet, basierend auf dem Wissen um Lektinspezifitäten ggü. Ser/Thr-Glykopeptiden und der Tatsache, dass mucinartige Glykopeptide generell um weitere Glykane verlängert vorliegen. αGlcNAc-Tyr, eine Modifikation, welche durch intrazelluläre Infektionen verursacht wird, wurde an Host-GTPasen gefunden. Eine Glykanzuordnung fand mittels enzymatischen In-Vitro-Studien sowie NMR-basierten Strukturbestimmungen statt. Weiter wurden im Rahmen einer umfangreichen Glykoproteom-Studie verschiedene HexNAc-Tyr-Modifikationen an mitochondriellen Proteinen gefunden, wobei einige der identifizierten Glykosylierungsstellen gleichzeitig bekannte Phosphorylierungsstellen darstellen. Daher handelt es sich bei diesen HexNAc-Tyr-Modifikationen wahrscheinlich um βGlcNAc-Tyr (obwohl diese Modifikation bis dato nicht verifiziert werden konnte). Um eine Identifikation von HexNAc-Tyr als mögliche Modifikation durch Glykoproteomanalysen zu ermöglichen, wurden Lektine, welche üblicherweise zur Glykopeptidaffinitätsanreicherung verwendet werden, hinsichtlich ihrer Bindungserkennung von HexNAc-Tyr und im Vergleich zu dessen Ser/Thr-Analoga, untersucht. Zu diesem Zweck wurde eine vielseitige Bibliothek bestehend aus HexNAc-Modellglykopeptiden synthetisiert, welche die Grundlage für Lektinbindungsstudien bildet. Der Beitrag von Glykopeptidstrukturelementen zur Erkennung durch üblicherweise zur Glykopeptidanreicherung verwendete Lektine (Vicia Villosa Agglutinin - VVA, Wheat Germ Agglutinin – WGA und Griffonia Simplicifolia Lectin II – GSL II) wurde durch Einsatz von Glykopeptidmicroarrays getestet. Dabei wurde der Einfluss von Glykan (αGalNAc/αGlcNAc/βGlcNAc), Akzeptoraminosäure (Tyr/Ser/Thr) sowie die Art der Glykanpräsentation (mono- vs divalent) untersucht. WGA und GSL II zeigten eine deutlichen Präferenz für Tyr-Glykopeptide ggü. Ser/Thr. Demgegenüber wurde keine solche Tyr-Präferenz für VVA gefunden. Das WGA-Lektin zeigte eine starke Bindung sowohl an GlcNAc-Tyr- als auch an GalNAc-Tyr-Glykopeptide und kommt somit für eine Strukturzuordnung von HexNAc-Tyr nicht in Betracht. Im Gegensatz dazu wurde für VVA eine hohe Spezifität für ausschließlich αGalNAc-Glykopeptide gefunden. GSL II erkannte sowohl αGlcNAc- als auch βGlcNAc-modifizierte Peptide. Für WGA wurde der Einfluss von divalenter Glykanpräsentation untersucht, wobei sich eine Abhängigkeit von der Peptidlänge zwischen den beiden Glykanen ergab. Generell resultierte eine Distanz von 2-5 Aminosäuren in erhöhter Glykopeptiderkennung. Zusammengenommen ermöglichen diese Ergebnisse eine verlässlichere Verwendung von Lektinen zum Zwecke der HexNAc-Tyr-Glykopeptidanreicherung. Des weiteren wurde die massenspektrometrische Oxoniumionenfragmentierung hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit zur HexNAc-Tyr-Glykopeptididentifikation untersucht. Es zeigte sich, dass die Methode voll Anwendbar ist zur Unterscheidung von GalNAc vs GlcNAc, jedoch nicht zur Zuordnung der jeweiligen anomerischen Konfiguration. Das hier generierte Wissen über Lektinaffinitäten in Kombination mit der oxoniumionenbasierten Glykanidentifikation wird großangelegte Glykoproteomstudien ermöglichen, in welchen die Tyr-O-Glykosylierung mit in Betracht gezogen wird. Dies könnte schließlich zur Klärung der Frage beitragen, ob βGlcNAc-Tyr eine tatsächlich existierende Modifikation ist. Der ultimative Beweis für dessen Existenz wäre jedoch die Beobachtung einer Tyr-Spezifität ausgehend von den βGlcNAc-Biosyntheseenzymen O-GlcNAc-Transferase (OGT) und O-GlcNAcase (OGA). Entsprechende, in dieser Arbeit durchgeführte Inkubationen von Glykopeptid-Substratkandidaten mit OGA ergaben eine deutliche OGA-Präferenz ggü. βGlcNAc-Tyr-Substraten im Vergleich zu Ser/Thr-Analoga. Entsprechende Inkubationen mit OGT verliefen bislang ergebnislos und benötigen weitere Untersuchungen.Item Charakterisierung der Wechselwirkung post-translationaler Modifikationen mittels Massenspektrometrie-basierter Proteomforschung(2018) Venne, Anna Saskia; Sickmann, Albert; Kayser, OliverItem Methodenentwicklung zur Analyse von Proteinen und Proteinkomplexen mittels Cross-Linking und Massenspektrometrie(2017) Tinnefeld, Verena; Sickmann, Albert; Kayser, OliverIn dieser Arbeit wurde die Analyse von Protein Cross-Links systematisch untersucht. Dabei wurde neben der Messung mittels LC-MS/MS auch die Auswertung mit speziellen Suchalgorithmen näher betrachtet. Die drei häufigsten Suchprogramme pLink, xQuest und StavroX wurden dabei miteinander verglichen. Mit diesen Ergebnissen wurden auch Kriterien für die Annahme oder Ablehnung von identifizierten Cross-Links festgelegt. Neben klassischem, chemischem Cross-Linking wurde auch versucht, photochemisches Cross-Linking zu optimieren. Zunächst wurde die Aktivierung der photoreaktiven Komponente mit einem gepulsten Laser getestet. Aufgrund des mangelnden Erfolgs wurde daraufhin die notwendige Aktivierungszeit des Reagenzes mit einer UV-Lampe bestimmt, um den Misserfolg des ersten Versuchs zu erklären. Darüber hinaus wurde die Anreicherung von Cross-Link Peptiden optimiert, um deren Identifizierung zu erleichtern. Anhand des bestehenden ChaFRADIC-Protokolls mit Kationenaustauschchromatographie wurden drei neue Anreicherungs-Protokolle für Cross- Link Peptide entwickelt. Da der ursprüngliche ChaFRADIC-Ansatz nicht auf Cross-Link Peptide übertragen werden konnte, wurden neue Modifikationen, Proteasen und Chromatographie-Techniken getestet und erfolgreich eingesetzt. Alle drei entwickelten Anreicherungsmethoden ermöglichten die Identifikation zusätzlicher Cross-Links in BSA mit unterschiedlicher Effizienz. Daneben wurden in Kooperation mit weiteren Forschungsgruppen weitere Proteine mittels Massenspektrometrie analysiert, um neue strukturelle Informationen zu erhalten. Erstmalig wurde der BBSome-Komplex aus sechs Proteinen mit Cross-Linking untersucht, um die Interaktion zwischen den einzelnen Protein-Untereinheiten zu bestimmen. Zusätzlich wurde die Interaktion zweier bakterieller Peptide (Cdc42 mit IbpA) über einen neuartigen ATPCross- Linker massenspektrometrisch bestimmt. Abschließend wurde in dieser Arbeit ein Peptid-Standard für Cross-Link Peptide entwickelt. Über ein neuartiges Reaktionsschema konnte eine große Anzahl von Cross-Link Peptide mit beliebiger Sequenz hergestellt werden. Eine Mischung aus 20 Standard-Peptiden wurde anschließend verwendet, um verschiedenen Fragmentierungsmethoden für Cross-Link Peptide miteinander zu vergleichen und die optimale Messmethode zu bestimmen.Item Methodische Entwicklungen zur Analyse von O- und N-Phosphorylierungen in Signalnetzwerken mittels Massenspektrometrie(2017) Dickhut, Clarissa; Sickmann, Albert; Tiller, JörgItem Characterizing protein processing in the Endoplasmic Reticulum using quantitative proteomics: the pathogenesis of the Marinesco-Sjörgren Syndrome(2016) Kollipara, Laxmikanth; Sickmann, Albert; Kayser, OliverItem Looking into living cell systems: Planar waveguide NMR detector hyphenated with a microfluidic device for the in vitro metabolomics of tumor spheroids(2015) Kalfe, Ayten; Tiller, Jörg; Franzke, JoachimUntersuchungen des komplexen Metabolismus von Zellen sowie der dazugehörigen Signalwege haben in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Aber der Mangel an ausgereiften analytischen Geräten, die für Metabolismus-Studien an lebenden Zellen nötig sind, stellt immer noch eine Herausforderung dar, die es zu bewältigen gilt. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neuartiger Mikrostreifenleiter-Detektor für die kernmagnetische Resonanz (NMR) mit einer integrierten Heizvorrichtung entwickelt und mit einem Mikrofluidikchip gekoppelt, der unter anderem als Probenhalter fungiert. Mit dieser neuen Methode wurden 3D in vitro Zellkulturmodelle (Sphäroide) analysiert, weil diese hervorragend die Lücke zwischen 2D Zellkulturmodellen und Tiermodellen überbrücken. Erstmalig wurde ein Tumorsphäroid, mit 500 μm Durchmesser und ca. 9000 Zellen, nichtinvasiv für 24 Stunden analysiert. Der dynamische Prozess der Produktion und des Abbaus von 23 intra- und extrazellulären Metaboliten konnte verfolgt werden. Bemerkenswert hohe Konzentrationen an Laktat und Alanin wurden beobachtet, was auf eine Verschiebung vom oxidativen zum glykolytischen Metabolismus hinweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich diese methodische Entwicklung als erfolgreiches analytisches Verfahren erwiesen hat, das zur Aufklärung von Zellfunktionen und ihrer zugrunde liegenden biochemischen Reaktionswege dient. Des Weiteren erlaubt die planare Geometrie des Mikrostreifenleiter NMR Detektors die Kopplung mit der vielseitigen Lab-on-a-chip (LOC) Technologie. Mit dieser Entwicklung eröffnen sich neue Perspektiven für Metabolismus-Studien an lebenden Zellen, die neue Anwendungsgebiete in der Biotechnologie und den Lebenswissenschaften eröffnen. Ziel ist es, das Gerät als diagnostisches Werkzeug zur Untersuchung von Zellantworten auf äußere Stressfaktoren in toxikologischen oder pharmazeutischen Studien zu verwenden, um somit später Tierexperimente zu ersetzen.Item Massenspektrometrische Charakterisierung von Phosphorylierungsstellen in mitochondrialen Membranen und Membran/Protein-Komplexen(2015) Eyrich, Beate; Sickmann, Albert; Kayser, OliverThis thesis represents a qualitative and quantitative phosphorylation analysis on mitochondrial proteins of the OM (engl. Outer Membrane) and of membrane/proteincomplexes. After enrichment by IEF, SCX, ERLIC and TiO2 as well as combinations of these methods all together 126 phosphopeptides were detected in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. Beside numerous peptides of OM-proteins 25 phosphosites of the TOM complex, 16 previously undetected, were found amongst. By optimization of loading and elution conditions of tianiumdioxid enrichment phosphosites could also be identified in mitochondria of different mouse organs and in human mitochondria. Out of 66 phosphopeptides characterized in mouse mitochondria solely the three phosphopeptides K.IEDVGpSDEEDDSGKDK.K (Hsp90ab1), R.YGMGTpSVER.A (Pdha1) and M.*AAAVAAAGAGEPLpSPEELLPK.A (Tom22, * = N-terminal acetylation) were found in all organs. The majority of phosphopeptides was only detected in one of the four organs - thereby 25 phosphosites were provided by kidney, followed by heart with 11 and brain/liver with 7 phosphorylated peptides each. In human mitochondria 21 phosphosites were identified, among them phosphopeptides of Tom22 and Tom70. Comparison of the TOM proteins Tom22 and Tom70 through yeast, mouse and human partly showed homologous phosphorylation patterns, leading to potential similar regulation by (de-) phosphorylation. By various enrichment strategies linked to quantification by SILAC differences in the phosphoproteome of yeast strains of CK2 wildtyp and temperature sensitive CK2 mutant could be demonstrated. Alternatively, two labelfree procedures for differential phosphopeptid analysis were presented and proven for their practicability by yeast mitochondria. Especially using synthetic (phospho) peptides and scheduled SRMs turned out to be a very sensitive and reproducible quantitaion method.Item Analyse des Proteinimports durch die äußere mitochondriale Membran von Saccharomyces cerevisiae(2015) Radau, Sonja; Sickmann, Albert; Kayser, OliverItem Synthesis and development of a mucin glycopeptide microarray system for evaluation of protein-interactions(2016) Pett, Christian; Waldmann, Herbert; Hedberg, ChristianItem Analytik niedermolekularer Metall-Liganden-Komplexe(2015) Köster, Jessica; Sickmann, Albert; Wirén, Nicolaus vonItem Development and characterization of in vitro microarray technologies for cell biology(2013-11-19) Hardelauf, Heike; Tiller, Jörg C.; Franzke, JoachimDie moderne Zellbiologie hat großes Interesse an Hochdurchsatz-Techniken, die reproduzierbare und quantitative Ergebnisse liefern. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung von Mikroarray-Technologien für Anwendungen in der Krebs-Therapie und der Neurotoxikologie. Die hier verwendeten Techniken und Werkzeuge basieren auf Mikrodruckverfahren („micropatterning“) für Zellen und sind Biologen weltweit zugänglich. PDMS (Polydimethylsiloxan) „microcontact printing“ (µCP) wurde für die parallele Massenproduktion von hochgradig homogenen 3D Tumor Sphäroiden verwendet. Die verschiedenen metabolischen Gradienten ebenso wie die auftretende Chemosensitivität machen dieses bio-analytische Modell zu einem verlässlichen Instrument für die in situ oder ex situ Analyse von potentiellen Krebsmitteln. Das Mikrodruckverfahren wurde weiterentwickelt, um ein räumlich angeordnetes analytisches System für neurotoxische Hochdurchsatz-Screenings mit standardisierten neuronalen Auswuchslängen zu entwickeln. Dies beinhaltete die Entwicklung einer neuen Methode, die Doppelmembranschicht Technik, welche mittels Plasma Strukturen in Oberflächen brennt. Die Doppelmembranschicht Technik ist einfach in der Anwendung, schnell, günstig, reproduzierbar und eine sehr effektive Methode um Neuronen strukturiert anzuordnen. Das „Network Formation Assay“(NFA) benutzt Verbindungen zwischen Neuronen als präzisen und sensitiven analytischen Endpunkt, um zwischen Zytotoxizität und Neurotoxizität zu unterscheiden. Zudem wurde das NFA an die Bedürfnisse und Wachstumsbedingungen von kortikalen Primärzellen (Goldstandard) und neuronalen Stammzellen angepasst. Das NFA wurden mittels µCP auf einer zellabweisenden Polyethylenglykol Oberfläche hergestellt. Diese Doktorarbeit demonstriert die Entwicklung von Mikroarray Technologien für die Umsetzung von räumlich angeordneten und standardisierten, hervorragend reproduzierbaren und für Hochdurchsatzverfahren geeigneten Zellassays, welche Probleme und Fragestellungen in der Zellbiologie angehen. Diese Assays wurden unter den Gesichtspunkten entwickelt, zuverlässig, günstig, einfach in der Handhabung und mit minimalem Wissen und Equipment durchführbar zu sein, damit möglichst viele Wissenschaftler die Systeme übernehmen und anwenden können.Item Globale qualitative und quantitative Proteomanalyse mittels hochauflösender LC‐MS(2013-10-18) Burkhart, Julia Maria; Sickmann, Albert; Meisinger, ChristofIn der vorliegenden Arbeit konnten Methoden für qualitätsbasierte Proteomanalyse mittels hochauflösender LC-MS basierend auf niedrig komplexen Modellproteomen entwickelt und als solche für die quantitative Untersuchung von Mitochondrien der Bäckerhefe und auch von humanen Thrombozyten angewendet werden. Die Arbeitsabläufe in der Proteomanalyse wurden beginnend vom (1) proteolytischen Verdau, über (2) die chemische Markierungsstrategie iTRAQ zur Quantifizierung, (3) die Interferenz von Reporterionen-basierten Markierungsstrategien in der MS-Analyse mit der in dieser Arbeit entwickelten Methodik iQUARi untersucht und optimiert werden. (4) Die Erhebung von Proteinverhältnissen auf Basis von Peptidverhältnissen mittels verschiedener statistischer Ansätze wurde evaluiert und mit dem redescending M-estimator die optimale Auswertung für Reporterionenbasierten Markierungsstrategien gefunden. Weiterhin wurde (5) die Auswertung von proteomischen Datensätzen mit Hilfe der FDR untersucht und optimiert. Die Etablierung einer stabil-Isotopen markierten Kontrollmixtur ermöglichte das Monitoring der LC-MS Performance und erlaubte weiterhin die online Kontrolle von LF Experimenten. Die genannten Kontrollwerkzeuge ermöglichten die Optimierung diverser Arbeitsschritte der quantitativen Proteomanalyse, die weiterhin erfolgreich zur Untersuchung höher komplexer Proteome angewendet wurden. So konnte mit der Untersuchung des humanen Thrombozytenproteoms mit ca. 4000 Proteinen die derzeit umfassendste Studie dieses Primärgewebes realisiert werden. Die Analyse der Proteinvariabilität eines Spenders bzw. unabhängiger Spender zeigte in verschiedenen quantitativen Analysestrategien (iTRAQ, LF) nur geringfügige Abweichungen. Die Anwendung der metabolischen stabil-Isotopen Markierung (SILAC) ermöglichte die Charakterisierung des mitochondrialen Intermembranraumproteoms von S. cerevisiae, das bislang nicht wegen seiner Komplexität, aber aufgrund der selektiven Isolierung eine Herausforderung für die Proteomanalyse darstellte. Der quantitative Ansatz erlaubte die deutliche Definition von nun insgesamt 50 Komponenten des IMS neben intermediär auftretenden Proteinen. Abschließend konnten die IMS Proteine in biochemischen Studien verifiziert werden. Für die Analyse von Degradationsprozessen in Mitochondrien konnten Ansätze zur Kontrolle der Proteinmengen auf Ebene von Proteinen sowie von Peptiden etabliert werden. Vorläufige Ergebnisse der Konsensussequenzanalyse weisen auf funktionale räumliche Einheiten für den Wirkungsraum von Proteasen hin, die eine weitere, detailreiche Charakterisierung erfordern.Item Physical characterization of the electroporation process on Escherichia coli C600 and Bacillus subtilis 168(2013-10-18) Brambach, Birgit Christiane; Franzke, Joachim; Weis, ThomasItem Miniaturisierte Entladungen in der instrumentellen Analytik mit Fokus auf der Entwicklung einer dielektrisch behinderten Mikrohohlkathodenentladung(2012-11-06) Meyer, Cordula; Franzke, Joachim; Neyer, AndreasItem Mass spectrometry based interaction study of the STIM1 and VASP proteins(2012-10-25) Premsler, Thomas; Sickmann, Albert; Hengstler, Jan GeorgItem Cell patterning for spatially standardized cell biology(2012-03-09) Frimat, Jean-Philippe; Hengstler, Jan Georg; Franzke, JoachimThe onus in modern cell biology is on the development of reproducible, develop cell patterning capabilities that are accessible to biologists and to demonstrate new and innovative analytical methods based on the spatial control of cell positioning for widespread cell biology applications as well as fundamental research applications. Plasma stencilling methods for cell patterning were developed which are simple, rapid, inexpensive, reproducible, effective and potentially universal cell line patterning techniques. PDMS micropatterning techniques were also developed to achieve a high resolution patterning capability over large areas and with absolute freedom of design while remaining efficient, cheap, simple and highly reproducible. These features make these methods accessible and desirable to biologists and microengineers alike. As a result from these developments, novel bio-analytical platforms were produced and innovative assays are presented. Cell patterning using these novel techniques was successfully used for the parallel and mass production of 3D spheroids, with high reproducibility and excellent control of the uniformity of spheroid size. A spatially standardized analytical display for high throughput neurotoxicity screening is also presented where cell patterning offers a route to standardize the neurite outgrowth lengths. In addition, a microfluidic system was also used to efficiently pattern and couple single cells by differential resistance pathway principles and validates the concept of using the natural behaviour of cells for mechanical operations within microengineered environments. Taken together, this thesis demonstrates that it is possible to exploit cell micropatterning technologies for the realization of spatially standardized, highly reproducible and quantitative cell biology assays for both fundamental research and commercial applications.Item Strategien für das Multielement-Labeling von Proteinen und Antikörpern für LA-ICP-MS-Anwendungen in der Proteomik(2010-11-10) Wäntig, Larissa; Deckert, Volker; Niemeyer, Christof M.