Entwicklung einer schaltbaren Protease und eines fluoreszenten Reporters mittels Inteinkassetten

Abstract

Gespaltene Inteine haben sich in den letzten Jahren als biochemisches und molekularbiologisches Werkzeug zur posttranslationalen Modifikation von Proteinen etabliert. Die Inteinhälften werden dabei separat auf zwei getrennten Fusionsgenen kodiert. Die Proteintrans- Spleißreaktion (PTS) beginnt nach der Assoziation und Faltung der Inteinhälften in den aktiven Komplex und verknüpft die fusionierten Sequenzen des Zielproteins durch eine native Peptidbindung. Ein kritischer Punkt dieser Reaktion ist die Abhängigkeit der Inteine von der Primärstruktur des Zielproteins und insbesondere von den an das Intein angrenzenden Aminosäuren. Diese können die Spleißreaktion beeinträchtigen oder sogar inhibieren. Um diese Effekte möglichst schnell und mit geringem Arbeitsaufwand für die Generierung von Inteinfusionsproteinen zu erkennen und zu umgehen, wurden in dieser Arbeit auf Inteinkassetten basierende Ansätze entwickelt. Der Vorteil dieser Inteinkassetten gründet sich auf der in einem Schritt stattfindenden „spurlosen“ Integration aller Inteinkomponenten in ein Zielgen durch homologe Rekombination oder restriktionsfreie PCR. Dabei ist die freie Wahl der flankierenden Aminosäuren über die zur Amplifikation gewählten Primer möglich. Letztendlich entfallen sowohl aufwendige Klonierungsarbeiten als auch die Addition von Restriktionsschnittstellen an die Inteingene, wobei letztere zu zusätzlichen Aminosäurecodons führen würden. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine bereits in der vorangegangenen Diplomarbeit generierte Inteinkassette verwendet, um konditionale Kontrolle über die Tabakätzvirus- (TEV)-Protease auszuüben. Diese Kontrolle ist möglich, weil das verwendete, künstlich gespaltene Saccharomyces cerevisiae VMA-Intein nur in Verbindung mit dem Heterodimerisierungssystem FRB/FKBP und unter Zugabe des Liganden Rapamycin die Spleißreaktion effizient durchführen kann. Die so induzierte PTS-Reaktion wird als konditionales Proteinspleißen (CPS) bezeichnet. Nach der Integration der Inteinkassette an neun unterschiedlichen Positionen des TEV-Proteasegens in Hefe wurden zwei Positionen identifiziert, die in einer schaltbaren TEV-Protease resultierten und zur selektiven Spaltung von Reporterproteinen mit einer TEV-Erkennungssequenz verwendet werden konnten. Dabei konnte die Spleißproduktbildung bereits nach 30 Minuten in Western-Blot-Analysen nachgewiesen und die Spaltungsaktivität der schaltbaren TEV-Proteasen mittels Konfokalmikroskopie in einzelnen Zellen verfolgt werden. Erste Experimente in Säugerzellen wiesen auch in diesem Modellsystem die Aktivität einer der beiden konditionalen Proteasen nach. Innerhalb eines zweiten Projektes wurden drei auf den gespaltenen Ssp DnaB, Npu DnaE und Mxe GyrA Inteinen basierende trans-Inteinkassetten entwickelt, die alle spontane Aktivität in der PTS-Reaktion zeigten. Dabei variierten die einzelnen Kassetten sowohl in ihrer Sequenzpräferenz als auch in den verschiedenen Aminosäuren, die nach der abgelaufenen Spleißreaktion im ligierten Zielprotein als Reste übrig blieben. Die Kassetten wurden so konzipiert, dass die nach der Zielgen-Integration entstandenen Fusionsgene selektiv in Escherichia coli exprimiert werden konnten. Für das Modellprotein gpD-Trx wurde zuerst die Funktionalität des Integrationsprozesses der Ssp DnaB- und Npu DnaE-Inteinkassetten gezeigt und anschließend die selektive Spleißproduktbildung mittels Western-Blot-Analyse verfolgt. Außerdem wurde die Npu DnaE-Inteinkassette in das CobA-Enzym - eine Uroporphyrinogen- III-Methyltransferase - integriert. Infolgedessen konnte rekonstituiertes CobA durch die Produktion von fluoreszierenden Tetrapyrrol-Derivaten als Biosensor für erfolgreiches Proteinspleißen verwendet werden. Die Aktivität des Proteins wurde über selektive Expression der Inteinfusionsgene in E. coli gesteuert. In der Übertragung dieses Systems auf Säugerzellen konnte die PTS-Reaktion sowie die Aktivität des CobA-Proteins mittels Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden.

In the last couple of years, split inteins were established as a biochemical and molecular biology tool for the posttranslational modification of proteins. To this end, the intein halves are expressed as two separate intein fusion genes. The actual protein trans-splicing (PTS) reaction takes place after the association and folding of the intein halves into an active complex. Eventually the process leads to the formation of a native peptide bond between both target protein sequences which were fused to the intein halves. A critical step in this reaction is the dependence of the intein on the primary structure of the fused target protein and in particular on the amino acids in direct contact with the intein. These flanking amino acids can impair or even inhibit the protein splicing reaction. The chosen way to recognize and to get rid of these intein related effects and additionally to streamline the fusion gene generation was based on intein cassettes. The advantage of the intein cassette is due to the one-step “traceless” integration process which inserts all intein related components into the gene of interest either via homologous recombination or restriction-free cloning. Even the free selection of the flanking amino acids is possible by simply varying the primers used in the amplification step. Moreover, tedious cloning efforts and the addition of restriction sites, which result in additional amino acid codons, are skipped. In the first part of this work, an intein cassette which was generated during my diploma thesis was used to exercise conditional control upon the Tobacco Etch Virus (TEV) protease. This control is possible, because the artificially split Saccharomyces cerevisiae VMA intein can only perform the protein splicing reaction if utilized in combination with the FRB/FKBP heterodimerizer system and by addition of the small molecule rapamycin. The induced PTS reaction is called conditional protein splicing (PTS). After the integration procedure of the intein cassette at nine different positions in the TEV gene in yeast, two switchable proteases were identified, all of which had the ability to cleave a reporter protein. For those conditional proteases the formation of splice product could be identified within 30 minutes after the addition of rapamycin in western blot analysis. Additionally, the cleavage events could be followed on a single cell basis by confocal microscopy. First experiments in cell culture even indicated activity of one of the CPS proteases in this model system. In a second project, three different intein cassettes were developed that were based upon the Ssp DnaB, Npu DnaE, and Mxe GyrA split inteins and all showed spontaneous activity in the PTS reaction. Thus, the intein cassettes differ in their sequence preference as well as in the persisting amino acid, which is the only remnant of the splicing reaction within the ligated target protein. Another feature of the intein cassette integration is that the resulting fusion genes can be selectively expressed in Escherichia coli. By using a model protein (gpDTrx) and the Ssp DnaB and Npu DnaE cassettes, the functionality of the integration procedure was demonstrated and subsequently the selective formation of the splice product was detected in western blot analysis. Furthermore, the Npu DnaE intein cassette was integrated into the CobA enzyme, a uroporphyrinogen III methyltransferase. The reconstituted CobA generates fluorescent tetrapyrrole derivatives which is why it could be used as a biosensor for successful protein splicing. The activity of the protein was controlled via selective expression of the intein fusion genes in E. coli. After the final transfer of this system to cell culture, the PTS reaction, as well as the resulting CobA activity was detected by fluorescence microscopy.