Quantitative Analyse des Survival of Motor Neuron(SMN)-Komplexes unter Verwendung von absoluter Quantifizierung SMN-Komplex-spezifischer Peptide durch synthetische stabilisotopenmarkierte Peptidanaloga

Abstract

Der SMN-Komplex ist eine makromolekulare Einheit, die aus neun festen Untereinheiten (SMN, Gemin2-Gemin8, Unrip) und verschiedenen transienten Faktoren (SmB/B’, SmE, SmF, SmG, SmD1-D3) aufgebaut ist. Die Hauptaufgabe des ubiquitären Komplexes umfasst die Assemblierung der U snRNPs im Cytoplasma und ihre Translokation in den Zellkern, wo sie am Aufbau des Spleißosoms beteiligt sind. Durch Mutation oder Deletion des SMN1-Gens kann dieser Prozess gestört sein und dadurch Spinale Muskelatrophie (SMA) auslösen. SMA ist die zweithäufigste autosomal rezessiv vererbbare Krankheit mit Todesfolge nach Mukoviszidose, die zu einer Degeneration der -Motorneuronen des Rückenmarks und damit zu einer Schwächung und einem Abbau der Muskulatur führt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung des humanen Survival of Motor Neuron-Komplex (SMN) hinsichtlich Zusammensetzung und Stöchiometrie mittels Anwendung von massenspektrometrischen Methoden. In diesem Zusammenhang wurde die native stöchiometrische Zusammensetzung des zentralen SMN-Komplexes mit zwei rekombinanten Komplexen verglichen, die beide eine in Verbindung mit SMA bekannte Mutation (Y272C, E134K) integriert hatten. Zu diesem Zweck wurden Wildtyp-SMN und die mutierten SMN-Analoga als GST-Fusions-Proteine zusammen mit Wildtyp-Gemin2, -Gemin6, -Gemin7 und -Gemin8 in Escherichia coli exprimiert. Nach Ernte und Lyse der Zellen wurde SMN auf einer Glutathion- Sepharose-Matrix angereichert und anschließend mittels verschiedener Methoden (Carbamidomethylierung, Trypsin-Verdau) für die massenspektrometrische quantitative Analyse vorbereitet. Des Weiteren wurden die Unterschiede zwischen dem cytoplasmatischen und dem nukleären SMN-Komplex, welche durch Zellkern-Cytoplasma-Trennung von HeLa-Zellen mittels eines modifizierten Roeder-Protokolls und anschließende Co-Immunopräzipitation gegen den SMNspezifischen Antikörper 7B10 erhalten wurden, untersucht. Für die Quantifizierung der SMN-Komplexe wurde Absolute Quantifizierung (AQUA) angewendet. Synthetische stabilisotopenmarkierte Petidanaloga wurden mit den nativen Proben in definierten Konzentrationen verdünnt und konnten während der massenspektrometrischen Analyse durch ihre Massendifferenz von 6 bis 10 Dalton im Vergleich zu den endogenen Peptiden detektiert werden. Zuvor mussten jedoch geeignete Peptidsequenzen ausgewählt werden, um eine reproduzierbare Quantifizierung zu gewährleisten. Dazu mussten die Peptide definierten Spezifikationen entsprechen (z.B. keine leicht modifizierbaren Aminosäuren oder keine überlesenen tryptischen Schnittstellen beinhalten). Die MS-Analyse wurde mittels Selected Reaction Monitoring (S/MRM) auf zwei unterschiedlichen Triple-Quadrupol-Systemen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die Übergänge und Systemparameter (Declustering Potential und Kollisionsenergie) für jedes einzelne Peptid optimiert und festgelegt. Alternativ wurde markierungsfreie Quantifizierung auf einem LTQ Obitrap Velos System angewandt. Die hohe Massengenauigkeit und Sensitivität des Hybrid-FT-MS-Systems erlaubt eine Quantifizierung der entsprechenden Mutterionen direkt aus der MS1-Spur (ohne Anwendung von Tandem-MS-Experimenten). Beide Strategien, S/MRM und MS1, erlauben eine Quantifizierung von Peptiden mit Konzentrationen bis 250 amol. Durch Optimierung des dargestellten Protokolls, war es möglich den Einfluss bekannter Patientenmutationen des SMN1-Gens auf die Stöchiometrie des SMNKomplexes zu untersuchen, sowie den Unterschied zwischen SMN-Komplexen des Cytoplasmas und des Zellkerns zu bestimmen. Dieses Projekt kann dazu beitragen sowohl die Assemblierung der U snRNPs besser zu verstehen, als auch neue Zielmoleküle für Diagnose und Therapie von genetischen Krankheiten wie SMA bereitzustellen.

Summary The SMN complex is a macromolecular protein entity consisting of nine fixed subunits (SMN, Gemin2-Gemin8, Unrip) and several transient factors (SmB/B’, SmE, SmF, SmG, SmD1-D3). The main function of this housekeeping complex comprises the assembly of U snRNPs in the cytoplasm and their export to the nucleus where they build up the spliceosome. As a result of mutations in the SMN1 gene this process can be defective and elicits Spinal Muscular Atrophy (SMA). SMA is the second most common autosomal recessive hereditary disease beside cystic fibrosis resulting in death. It leads to a degeneration of the -motor neurons of the spinal cord and subsequently to muscular weakness and wasting. The aim of this study was the characterization of the human Survival of Motor Neuron (SMN) complex composition and stoichiometry by mass spectrometry. In this context, the native stoichiometric composition of the SMN core complex was compared with two recombinant complexes, each incorporating a known mutation (Y272C, E134K) involved in SMA. For this purpose wildtype SMN and mutated versions thereof were expressed as GST-fusion proteins together with full length Gemin2, Gemin6, Gemin7 and Gemin8 in E.coli. After harvesting and lysis of the cells the SMN complex was enriched on a glutathione-sepharose resin and further prepared by carbamidomethylation and tryptic digestion for a quantitaive massspectrometric analysis. Furthermore, the differences between the cytoplasmic and the nuclear SMN complex both derived from nuclei-cytoplasm separation of HeLa cells by a modified Roeder protocol and subsequent Co-immunoprecipitations against the SMN-specific antibody 7B19 were examined . In order to quantify the SMN core complex absolute quantification (AQUA) was applied. Stableisotope labeled peptide analogs were spiked to the native sample in defined amounts thus introducing a mass difference of 6-10 Da during the massspectrometric analysis. Preliminarily, appropriate peptides that meet several conditions (e.g. no labile amino acids, no missed tryptic digestion sites) to allow for a confident quantification were chosen. As MS-analysis was performed by Selected Reaction Monitoring (S/MRM) on two different triple quadrupol systems, transitions and parameters (Declustering Potential and Collision Energy) for each respective peptide were optimized . Alternatively, label-free quantitation on the LTQ Orbitrap Velos was applied. The high mass accuracy and sensitivity of this hybrid FT MS allows quantifying the respective parent ions directly from the MS1 trace. Both strategies, S/MRM and MS1, provide a linear quantification of peptides down to a concentration of 250 amol. By optimizing the current workflow, it was possible to determine the stoichiometry of SMN-complexes containing several known patient mutations within the SMN1 gene as well as discovering the differences between SMN-complexes originating either from cytoplasm or from nucleus. This project may help to throw a light on the assembly of U snRNPs and provide new targets in diagnosis and therapy for genetic diseases like SMA.