Identification and characterization of novel hedgehog signaling pathway inhibitors and their cellular targets

Abstract

As a major developmental pathway, Hedgehog (Hh) signaling is required for segment polarity in Drosophila and limb pattering in vertebrates. Since its discovery 40 years ago, several studies have identified various pathway components and helped to elucidate the underlying mechanisms of signal transduction. Nevertheless, some regulatory steps during pathway induction are not yet fully understood. Similar to other developmental pathways like Wnt, TGFβ or Notch signaling, also Hh signaling plays a central role in cancer, e.g. medulloblastoma and basal cell carcinoma. Due to the open questions concerning pathway mechanisms and the relevance in some forms of cancer, novel modulators of Hh signaling are in high demand. Following a high-throughput screen for inhibition of Purmorphamine-induced osteogenesis, six inhibitors of Hedgehog signaling were characterized in this thesis. All compounds inhibited GLI-responsive reporter gene expression and suppressed the expression of Hh target genes. Two compounds, a withanolide A- and a pyrazolo-imidazole derivative bind to the heptahelical bundle of SMO, a membrane protein and central transducer of Hh signaling activity also known as the most druggable target of the Hh signaling pathway. The pyrazolo-imidazole derivative, termed Smoothib, impairs ciliary entry of SMO and most likely adopts a binding mode similar to that of SANT-1, a SMO antagonist that is effective against resistant SMO mutants. Four further compounds, quinoline-, indole-, azepinone- and thienopyrimidine derivatives, did not bind to the cyclopamine binding site of SMO. Screening of a kinase panel revealed that the thienopyrimidine derivative, termed Pipinib, selectively inhibits phosphatidylinositol 4-kinase IIIβ (PI4KB) in an ATP-competitive manner. This lipid kinase is required for production of phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) and necessary for proper function and integrity of the Golgi apparatus as well as membrane trafficking and protein transport from the trans-Golgi network to the plasma membrane. Cellular levels of PI4P were reduced upon treatment with Pipinib, suggesting that PI4KB is inhibited by the compound in cells. PI4KB was validated as a positive regulator of Hh signaling via chemical and genetic depletion. PI4KB depletion sensitizes cells towards treatment with Pipinib, suggesting that PI4KB mediates Hh inhibition of Pipinib. Mode of action studies revealed that Pipinib impairs ciliary trafficking of PI4KB and that PI4KA inhibition only leads to minor reduction of Hh signaling. In combination with an already published role of PI4P in SMO activation, the results of this thesis lead to the conclusion that PI4KB is a major PI4-kinase source of PI4P that is required for SMO activation and transduction of Hh signaling activity.

Als ein bedeutender entwicklungsbiologischer Signalweg ist der Hedgehog (Hh)-Signalweg verantwortlich für die Segmentpolarität in Drosophila und die Extremitätenentwicklung in Vertebraten. Seit seiner Entdeckung vor 40 Jahren wurden zahlreiche Mitglieder der zugehörigen Signalkaskade identifiziert. Nichtsdestotrotz wurden einige Schritte des Signalwegs bisher noch nicht komplett aufgeklärt. In Analogie zu anderen entwicklungsbiologischen Signalwegen spielt auch die Hh-Signaltransduktion eine zentrale Rolle in gewissen Krebserkrankungen, z.B. beim Medulloblastom und Basalzellkarzinom. Aufgrund der offenen Fragen bezüglich der Signaltransduktion und der Relevanz für die Krebsentstehung werden neue Hh-Modulatoren dringend gesucht. Ausgehend von einem Hochdurchsatz-Screening für Inhibitoren der Purmorphamin-induzierten Osteogenese wurden im Rahmen dieser Arbeit sechs Inhibitoren des Hh-Signalwegs charakterisiert. Alle Substanzen inhibierten GLI-vermittelte Reportergen- und Hh Zielgenexpression. Ein Withanolid A- und ein Pyrazolo-Imidazol-Derivat binden an das heptahelikale Bündel von SMO, ein Membranprotein, das für die Signalweiterleitung verantwortlich ist und als am besten zu inhibierendes Zielprotein im Signalweg gilt. Das Pyrazolo-Imidazol-Derivat, genannt Smoothib, beeinträchtigt den ziliären Eintritt von SMO und bindet SMO in einem Modus, der dem bekannten SMO-Inhibitor SANT-1 gleicht, welcher Resistenzen gegenüber SMO Antagonisten überwinden kann. Vier weitere Substanzen, ein Chinolin-, ein Indol-, ein Azepinon- und ein Thienopyrimidin-Derivat binden nicht an die Cyclopamin-Bindungsstelle von SMO. Die Bestimmung der Inhibition von Kinasen ergab, dass das Thienopyrimidin-Derivat, genannt Pipinib, die Phosphatidylinositol 4-Kinase IIIβ (PI4KB) selektiv und ATP-kompetitiv inhibiert. Diese Lipidkinase ist wichtig für die korrekte Funktion und Integrität des Golgi-Apparats sowie den Membrantransport und den Transport von Proteinen vom trans-Golgi-Netzwerk zur Plasmamembran. Die Behandlung mit Pipinib führte zur Reduktion der zellulären PI4P-Pegel, was zur Annahme führte, dass PI4KB auch in Zellen durch Pipinib inhibiert wird. PI4KB wurde mittels chemischer und genetischer Depletion als positiver Regulator des Hh Signalwegs validiert. Depletion von PI4KB führte zu einer Sensibilisierung der Zellen gegenüber Pipinib. Dies spricht dafür, dass PI4KB die inhibitorische Wirkung von Pipinib auf den Hh Signalweg vermittelt. Die Substanz beeinträchtigt die ziliäre Lokalisation von SMO. Die Inhibition von PI4KA hingegen, führt nur zu einer geringen Inhibition des Hh-Signalwegs. In Kombination mit einer bereits veröffentlichten Rolle von PI4P in der Aktivierung von SMO, führen die Ergebnisse dieser Arbeit zu dem Schluss, dass PI4KB eine wichtige Quelle für PI4P darstellt, welches für die Aktivierung von SMO und die Weiterleitung des Hh-Signals entscheidend ist.