Struktur-basiertes Design, Synthese und pharmakokinetische Charakterisierung von kovalenten Inhibitoren zur Adressierung von Krebs-relevanten Proteinkinasen

Abstract

Die vorliegende Arbeit beinhaltet zwei Abschnitte: (i) die pharmakokinetische Charakterisierung von Inhibitoren mit dem Fokus auf der Analyse der metabolischen Stabilität in Anwesenheit von Lebermikrosomen, die einen Phase I Metabolismus nachbilden. Hierzu wurde ein entsprechendes Assaysystem in der Arbeitsgruppe etabliert. (ii) Das Struktur basierte Wirkstoffdesign, die organische Synthese von niedermolekularen Verbindungen und deren Charakterisierung, mit dem Ziel selektive und potente Inhibitoren für Krebs relevante Proteinkinasen zu identifizieren. Die Kombination aus biochemischem Aktivitätsassay und zellulärem Viabilitätsassay erlaubte eine Bewertung der generierten Substanzbibliotheken. Massenspektrometrische Studien ermöglichten die Analyse der kovalenten Adressierung des Zielproteins, sowie Komplexkristallstrukturen verwendet wurden, welche tiefere Einblicke in die Bindungsmodi der Inhibitoren erlaubten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Phase I Metabolismus Assays etabliert, der einen wichtigen Beitrag zur Optimierung und Weiterentwicklung der Inhibitoren leistet. Der Assay wurde in Gegenwart von humanen und murinen Lebermikrosomen durchgeführt, welche die Cytochrom P450 Enzyme beinhalten, durch die die Mehrheit der auf dem Markt zugelassenen Wirkstoffe abgebaut werden. Untersucht wurde die metabolische Stabilität von 200 Verbindungen über die Zeit, sodass Parameter wie die Halbwertszeit (t1/2) und die intrinsische Clearance (CLint) für eine Vielzahl an Verbindungen aus unterschiedlichen Projekten bestimmt und mit Referenzverbindungen verglichen werden konnten. Die Proteinkinase MKK7 ist Teil des JNK Signalwegs, dessen Fehlregulierung in neurodegenerativen Erkrankungen sowie bei Herzinfarkten mit darauffolgenden ischämischen Reperfusionsschäden identifiziert wurde. Unzureichende Selektivitätsprofile und mangelnde Wirksamkeit wurden bislang für JNK Inhibitoren beschrieben, weshalb die Adressierung der JNK aktivierenden Kinase MKK7 eine gute Alternative darstellt die genannten Selektivitätsmängel zu umgehen. Der literaturbeschriebene, potente Pyrazolopyrimidin-basierte kovalente MKK7 Inhibitor 24 sollte in komplexen zelluläre in vitro und ersten in vivo Modellsystemen getestet werden, weshalb zunächst ein Gramm der Verbindung hergestellt wurde. Die Identifizierung einer geeigneten Formulierung für die Substanz sowie die Bestimmung der maximal tolerierbaren Dosis bildeten die Grundlage für erste in vivo Mausstudien. Aus diesen ging bei 600 mg pro kg Körpergewicht der Maus durch IV Applikation eine maximale Plasmakonzentration von 5 µM hervor, sowie eine gute Verträglichkeit der Substanz. Die nur mäßige Löslichkeit der Verbindung stellte sich als problematisch dar, weshalb verschiedene Salzformen dargestellt wurden, von denen das HCl Salz 34 eine verbesserte Löslichkeit zeigte. Weiterhin wurde der Einfluss von 24 auf Reperfusionsschäden infolge eines Herzinfarktes in Mausmodellen untersucht. Hierbei wurden Herzinfarkte induziert und durch die präventive Vorab Gabe der entstandene ischämische Reperfusionsschaden im Vergleich zu unbehandelten Mäusen analysiert. Basierend auf den bislang erzielten Ergebnissen lässt sich ein geringerer ischämischer Reperfusionsschaden bei vorheriger Verabreichung von 24 vermuten. Die Behandlung von Krebs wurde in den letzten Jahren durch den Ansatz der Präzisionsmedizin revolutioniert. Hierbei können durch die Identifizierung von prädiktiven Biomarkern große Patientenpopulationen in Subgruppen unterteilt werden, die somit eine individuelle und maßgeschneiderte Therapie erhalten. Die zielgerichtete Adressierung mit TKIs wurde erfolgreich für die Proteinkinasen EGFR, KIT und PDGFR beschrieben. Her2, ein Mitglied der ErbB Rezeptorfamilie, wurde bei etwa 4 % aller Patienten mit NSCLC als Treiber identifiziert, wovon ca. 80 % Insertionsmutationen in Exon20 entsprechen. Geringe Überlebens und Ansprechraten von < 40 % auf die bislang angewendeten Therapien mit TKIs verdeutlichen den dringenden Bedarf an wirksamen Inhibitoren für Krebspatienten mit positivem Her2 Mutationsstatus. In dieser Arbeit wurden kovalente, Pyrrolopyrimidin basierte Typ II Inhibitoren mit dem Ziel weiterentwickelt, die Löslichkeit der Inhibitoren durch Einführung von Löslichkeitsgruppen zu steigern und somit eine verbesserte zelluläre Aktivität erzielen zu können. Durch Einbringung von polaren Alkohol und Amin-funktionalitäten in ortho Position zum Michael Akzeptor wurde eine gesteigerte biochemische, aber gleichbleibende zelluläre Aktivität festgestellt. Kristallisationsstudien verifizierten den angenommenen Bindungsmodus und die pharmakokinetische Charakterisierung zeigte bspw. Optimierungsbedarf bzgl. der Stabilität in murinem Blutplasma sowie in Lebermikrosomen. Mutationen in den Proteinkinasen KIT und PDGFR wurden bei der Mehrheit von Patienten mit gastrointestinalen Stromatumoren identifiziert. Die derzeitig zugelassenen Wirkstoffe für die Behandlung von GIST sind reversible, ATP kompetitive Inhibitoren, von denen lediglich Avapritinib und Ripretinib speziell für die Therapie von GIST entwickelt wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde basierend auf der Ponatinibstruktur eine Substanzbibliothek von Typ II bzw. Typ III Inhibitoren synthetisiert. Diese wurden mit einer reaktiven Gruppe dekoriert, um eine kovalente Bindung mit Cys788 oder Cys809 in KIT bzw. Cys814 oder Cys835 in PDGFR auszubilden. In MS und MS/MS Experimenten konnte die spezifische Bindung der synthetisierten Inhibitoren an Cys788 in KIT nicht nachgewiesen werden. Ferner wurden einzigartige, Patienten abgeleitete PDGFR mutierte Zelllinien entwickelt und in einem HTS eingesetzt. Die Durchmusterung von fokussierten Kinaseinhibitor-bibliotheken sollte zukünftig neue Leitstrukturen identifizieren, um spezifische Inhibitoren für PDGFR mutierte gastrointestinale Stromatumore designen und synthetisieren zu können.