Multi-OMICS analysis of stem cell-derived hepatocyte-like cells reveals a liver-intestine hybrid state that can be targeted by bioinformatics-guided interventions

Abstract

Humane, induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) zeigen Potenzial für die therapeutische Applikation in der personalisierten Medizin, sowie die Verwendung zur Entwicklung von Modellsystemen in pharmakologischen und toxikologischen Studien. Die Differenzierung von iPSC zu Hepatozyten-ähnlichen Zellen wurde durch eine Vielzahl an Protokollen realisiert, wobei die resultierenden Zellen ein variierendes Ausmaß phänotypischer Reife aufweisen. Die genomweite Expression zeigt enorme Unterschiede zu primären Hepatozyten (PHH), veranschaulicht an Hand der Expression von Leber- wie auch Darm-assoziierten Genen. In dieser Arbeit wurde die Differenzierung von iPSC über definitive Endoderm (DE) zu HLC mittels Einzelzell- sowie Bulk-RNA-Sequenzierung und epigenetischen Analysen charakterisiert. Für die Auswertung wurde eine überwachte Strategie zur Gruppierung von Genen mit ähnlichen Expressionsverläufen in Differenzierungsmuster-Gruppen (DPG) entwickelt. Diese DPGs wurden mit bioinformatischen Methoden analysiert um Gen-Netzwerke und Regulatoren zu identifizieren, die zu gewünschter oder auch unerwünschter Differenzierung beitragen. Epigenetische Analysen konnten zeigen, dass eine Verbindung zwischen der Zugänglichkeit von Chromatin und der Expression erwünschter und unerwünschter Faktoren besteht und dass HLC im Vergleich zu PHH eine globale hyper-Methylierung ihrer Promoterregionen aufweisen. Dies legt grundsätzlich nahe, dass HLC nicht die für Hepatozyten charakteristische epigenetische Landschaft ausbilden. Außerdem konnte mittels Einzelzell-Sequenzierung gezeigt werden, dass HLC eine einzige Zellpopulation darstellen, welche in einem Hybridzustand verharrt, in dem Hepatozyten-assoziierte Gene zusammen mit unerwünschten – hauptsächlich Darm-assoziierten - Genen, die weder in adulten noch fetalen primären Hepatozyten vorkommen, exprimiert werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass in der Differenzierung von HLC in vitro wichtige Signale fehlen, die der Differenzierung von Hepatozyten in vivo zu Grunde liegen. Analysen zur Überrepräsentation von Gen-Regulatoren, die zwischen HLC, fetalen und adulten primären Hepatozyten unterschiedlich exprimiert werden, deuteten auf eine zentrale Rolle für den Kernrezeptor FXR hin. Die Kombination von FXR Expression und Aktivierung des Rezeptors durch Agonisten konnte die Expression von Hepatozyten-assoziierten Genen fördern, während die Expression unerwünschter Darmgene teils unterdrückt wurde. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, wie die HLC Differenzierung durch gezielte Manipulation von Gennetzwerken verbessert werden kann.

Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cells hold much promise for future cell therapy applications in the field of personalized regenerative medicine and offer an unlimited source of cell material for all branches of life-science associated research, including their use as model systems in pharmacological and toxicological studies. Differentiation of iPSC to hepatocyte-like cells (HLC) has been achieved in vitro by a number of differentiation protocols showing varying degrees of phenotypic maturity. However, their genome-wide expression patterns still differ significantly from primary human hepatocytes (PHH) in that they express liver- as well as intestine-associated genes. In this PhD thesis, differentiation of iPSC via definitive endoderm (DE) to HLC was characterized by single cell, as well as bulk RNA-sequencing with complementary epigenetic analyses. A supervised clustering strategy was developed to identify genes that exhibit similar expression dynamics during the differentiation of iPSC to HLC and assign them into differentiation pattern groups (DPG). These DPGs were analyzed by bioinformatics procedures to identify gene networks and regulatory factors that are likely to contribute to hepatocyte (favorable) or non-hepatocyte (adverse) differentiation. Epigenetic analysis showed global hypermethylation of promoters in iPSC- derived cells compared to PHH and that there is a link between chromatin accessibility and favorable and adverse gene expression, suggesting that HLC fail to acquire an epigenetic landscape characteristic of PHH. Strikingly, single cell RNA-seq revealed that favorable and adverse gene expression occurs in a single population of HLC, rather than subpopulations. Thus, HLC exist in a hybrid state, where hepatocyte-associated genes are expressed in concert with genes that are not expressed in PHH or fetal hepatocytes (FH) - mostly intestinal genes - within the same cell. This finding highlights a substantial lack of developmental cues required to guide lineage-specific differentiation of iPSC to hepatocytes. Overrepresentation analysis at the bulk level, as well as regulon analysis at the single cell level, identified sets of regulatory factors that differ between HLC, FH, and PHH, hinting at a central role for the nuclear receptor FXR in the functional maturation of HLC. Combined FXR expression plus agonist exposure enhanced the expression of hepatocyte-associated genes and suppressed undesired non-liver gene expression, thereby improving HLC similarity to PHH.