Lehrstuhl Technische Biologie

Permanent URI for this collection

http://hdl.handle.net/2003/37921

Browse

Now showing 1 - 8 of 8

Myxococcus xanthus as host for the production of benzoxazoles
(2022-12-09) Winand, Lea; Lernoud, Lucia; Meyners, Saskia Anna; Kuhr, Katharina; Hiller, Wolf; Nett, Markus
Benzoxazoles are important structural motifs in pharmaceutical drugs. Here, we present the heterologous production of 3-hydroxyanthranilate-derived benzoxazoles in the host bacterium Myxococcus xanthus following the expression of two genes from the nataxazole biosynthetic gene cluster of Streptomyces sp. Tü 6176. The M. xanthus expression strain achieved a benzoxazole titer of 114.6±7.4 mg L−1 upon precursor supplementation, which is superior to other bacterial production systems. Crosstalk between the heterologously expressed benzoxazole pathway and the endogenous myxochelin pathway led to the combinatorial biosynthesis of benzoxazoles featuring a 2,3-dihydroxybenzoic acid (2,3-DHBA) building block. Subsequent in vitro studies confirmed that this crosstalk is not only due to the availability of 2,3-DHBA in M. xanthus, rather, it is promoted by the adenylating enzyme MxcE from the myxochelin pathway, which contributes to the activation of aryl carboxylic acids and delivers them to benzoxazole biosynthesis.
Investigation and genetic engineering of heterologous hosts for the production of cyanobacterial compounds
(2022) Tippelt, Anna; Nett, Markus; Ziemert, Nadine
Cyanobakterien sind eine wertvolle Ressource für die Entdeckung neuer, bioaktiver Sekundärmetabolite. Insbesondere im letzten Jahrzehnt wurde durch die rasante Entwicklung verbesserter Genomsequenzierungstechniken und bioinformatischer Analyse-Tools nicht nur ihre genetische Beschaffenheit, sondern auch ihr enormes Biosynthesepotential weiter erschlossen. Industriell bleiben diese wertvollen Ressourcen jedoch meist ungenutzt, was auf Kultivierungsschwierigkeiten, eingeschränkte Biosynthesekapazitäten sowie gentechnische Unzugänglichkeit der nativen Produzenten zurückzuführen ist. Biotechnologische Lösungskonzepte, wie die Anwendung heterologer Produktionssysteme eröffnen eine Möglichkeit zur industriellen Erschließung dieses Biosynthesepotentials. Die in dieser Arbeit durchgeführte Genomsequenzierung ermöglichte faszinierende Einblicke in die genomische Struktur und das Biosynthesepotential des bisher unsequenzierten Cryptophycinproduzenten Nostoc sp. ATCC 53789. So ergab sich das Bild eines 8,7-Mb großen Genoms mit 13 Replikons, dessen Biosynthesepotential typische cyanobakterielle Charakteristika mit überwiegend peptidischen Sekundärmetaboliten aufwies. Die Mehrheit der Biosynthesegencluster (BGCs) entfiel auf das Chromosom. Insgesamt 17% der BGCs, darunter auch der Cryptophycin-Locus, erwiesen sich als Plasmid-assoziiert. Zur Erschließung des cyanobakteriellen Biosynthesepotentials wurden unterschiedliche heterologe Wirtsorganismen, aber auch alternative, zellfreie Produktionssysteme untersucht, wobei sich letztere aufgrund unterschiedlicher Substratpräferenzen als ineffektiv erwiesen. Hingegen konnten die entwickelten in vivo Systeme, hier S. cerevisiae und E. coli, erfolgreich für die Rekonstitution und Genexpression kleiner Biosynthesegene und multimodularer Assemblierungslinien, wie Scytonemin und Cryptophycin, getestet werden. Diesbezüglich dokumentierte die effektive Rekonstruktion des Cryptophycin-Clusters erstmals die Genexpression einer bakteriellen, multimodularen NRPS-PKS-Assemblierungslinie in S. cerevisiae. Als zentrale Herausforderung gestaltete sich im Allgemeinen die Expression großer Biosntheseproteine in den heterologen Wirten sowie die Konstruktion eines eukaryotischen Plattformorganismus zur Expression großer bakterieller Gen-Cluster. Die Installation von Löslichkeits-Tags zur Vermeidung dysfunktionaler Proteinaggregate sowie die Etablierung eines vielseitig einsetzbaren Bakterien-Hefe-Klonierungssystems bildeten dabei erfolgreiche Lösungskonzepte. Die Metabolitenproduktion in den bisher nicht optimierten Chassisorganismen wurde anschließend analysiert, wobei eine hohe Zusatzbelastung des Zellstoffwechsels, eine geringe Präkursorenverfügbarkeit, die abweichende Codonverwendung und konkurrierende Stoffwechselwege als zentrale Engpässe identifiziert wurden.
Bioengineering of anti-inflammatory natural products
(2020-11-19) Winand, Lea; Sester, Angela; Nett, Markus
Inflammatory processes occur as a generic response of the immune system and can be triggered by various factors, such as infection with pathogenic microorganisms or damaged tissue. Due to the complexity of the inflammation process and its role in common diseases like asthma, cancer, skin disorders or Alzheimer's disease, anti-inflammatory drugs are of high pharmaceutical interest. Nature is a rich source for compounds with anti-inflammatory properties. Several studies have focused on the structural optimization of natural products to improve their pharmacological properties. As derivatization through total synthesis is often laborious with low yields and limited stereoselectivity, the use of biosynthetic, enzyme-driven reactions is an attractive alternative for synthesizing and modifying complex bioactive molecules. In this minireview, we present an outline of the biotechnological methods used to derivatize anti-inflammatory natural products, including precursor-directed biosynthesis, mutasynthesis, combinatorial biosynthesis, as well as whole-cell and in vitro biotransformation.
Genomics-assisted chemical exploration of the secondary metabolomes of Massilia and Acidovorax species
(2022) Diettrich, Jan; Nett, Markus; Tischler, Dirk
Biosynthetic plasticity as a means for the discovery and diversification of natural products
(2021) Sester, Angela; Nett, Markus; Pietruszka, Jörg
Naturstoffe inspirieren fortwährend die Arzneistoffentwicklung, da sie zentrale Ausgangspunkte für die Strukturmodifikation und -optimierung darstellen. Daher ist die Entdeckung neuer Sekundärstoffe und ihrer biologischen Aktivität von zentraler Bedeutung, ebenso wie Studien zu entsprechenden Struktur-Wirkungsbeziehungen. Diese Arbeit zeigt, wie Präkursor-gesteuerte Biosynthese als universell einsetzbare Methode zur Untersuchung diverser Forschungsfragen eingesetzt werden kann. Die Derivatisierung der myxobakteriellen Naturstoffe Myxochelin B, Pseudochelin A, sowie Aurachin D gibt Einblicke in die natürliche Promiskuität der Biosynthesewege. Durch Zugabe von Benzoesäureanaloga in einem rekom- binanten Myxococcus xanthus Stamm, wurde die Produktion von Myxochelin B und Pseudochelin A gesteigert, sowie auch 14 Derivate dieser Naturstoffe erzeugt. Es wurde gezeigt, dass diese Produkte eine ähnliche oder bessere Bioaktivität bezüglich der humanen 5-Lipoxygenasehemmung aufweisen als die zuvor getesteten Myxochelin A-Analoga. Auf diese Weise konnte das bisherige Wissen über ihre Struktur-Wirkungsbeziehungen erweitert werden. Zudem wurde Stigmatella erecta genutzt, um drei fluorierte Aurachin D Analoga zu generieren, welche eine vergleichbare antibiotische Potenz hatten wie die in der Natur gebildete Verbindung. Ferner wurde in zwei Modellstämmen eine Methode zur Wirkstoffsuche entwickelt und getestet, die auf dem biosynthetischen Einbau von nicht natürlich vorkommenden, acetylenischen Präkursoren in Naturstoffe, der anschließenden Derivatisierung durch Click Chemie und UV/VIS Visualisierung beruht. Untersuchungen an M. xanthus, aber auch an Ralstonia solanacearum zeigten, dass sich Aminosäuren als biosynthetische Bausteine nur selten durch Analoga mit acetylenischen Funktionen ersetzen lassen. Die Zufuhr von Fettsäuren mit terminaler Alkinylgruppe war jedoch erfolgreicher und einige wurden in quantitativen Ausbeuten inkorporiert. Dies gelang u.a. in der Biosynthese des Antibiotikums Micacocidin, in welcher ein 5-Hexinsäure-haltiges Derivat generiert werden konnte. Dagegen war der Ralsolamycin-Biosyntheseweg weniger tolerant gegenüber den Fettsäureanaloga, lieferte aber dennoch messbare Mengen der alkinylhaltigen Produkte. Dieser Einsatz als chemische Sonden lieferte Erkenntnisse über die möglichen Inkorporationsmöglichkeiten, zeigte jedoch auch die Grenzen der Derivatisierung von Rohextraktproben auf.
Saccharomyces cerevisiae as host for the recombinant production of polyketides and nonribosomal peptides
(2021-08-19) Tippelt, Anna; Nett, Markus
As a robust, fast growing and genetically tractable organism, the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is one of the most widely used hosts in biotechnology. Its applications range from the manufacturing of vaccines and hormones to bulk chemicals and biofuels. In recent years, major efforts have been undertaken to expand this portfolio to include structurally complex natural products, such as polyketides and nonribosomally synthesized peptides. These compounds often have useful pharmacological properties, which make them valuable drugs for the treatment of infectious diseases, cancer, or autoimmune disorders. In nature, polyketides and nonribosomal peptides are generated by consecutive condensation reactions of short chain acyl-CoAs or amino acids, respectively, with the substrates and reaction intermediates being bound to large, multidomain enzymes. For the reconstitution of these multistep catalytic processes, the enzymatic assembly lines need to be functionally expressed and the required substrates must be supplied in reasonable quantities. Furthermore, the production hosts need to be protected from the toxicity of the biosynthetic products. In this review, we will summarize and evaluate the status quo regarding the heterologous production of polyketides and nonribosomal peptides in S. cerevisiae. Based on a comprehensive literature analysis, prerequisites for a successful pathway reconstitution could be deduced, as well as recurring bottlenecks in this microbial host.
Biosynthetic plasticity enables production of fluorinated aurachins
(2020-03-26) Sester, Angela; Stüer-Patowsky, Katrin; Hiller, Wolf; Kloss, Florian; Lütz, Stephan; Nett, Markus
Room for a halogen: The plasticity of the aurachin biosynthetic pathway in the myxobacterium S. erecta was explored for the use of fluoro- and chloroanthranilic acids. Incorporation of the unnatural precursors was quantified. Three fluorinated aurachin analogues were produced in sufficient quantity to enable their antibacterial activities to be assessed. Enzyme promiscuity has important implications in the field of biocatalysis. In some cases, structural analogues of simple metabolic building blocks can be processed through entire pathways to give natural product derivatives that are not readily accessible by chemical means. In this study, we explored the plasticity of the aurachin biosynthesis pathway with regard to using fluoro- and chloroanthranilic acids, which are not abundant in the bacterial producers of these quinolone antibiotics. The incorporation rates of the tested precursor molecules disclosed a regiopreference for halogen substitution as well as steric limitations of enzymatic substrate tolerance. Three previously undescribed fluorinated aurachin derivatives were produced in preparative amounts by fermentation and structurally characterized. Furthermore, their antibacterial activities were evaluated in comparison to their natural congener aurachin D.
Untersuchungen zur Biosynthese und Funktion von Myxochelinen in Myxobakterien
(2018) Korp, Juliane; Nett, Markus; Schäberle, Till
The myxochelins were first mentioned in the literature nearly 30 years ago and described as catechol-type siderophores produced by myxobacteria. Since then, totally eight members of this compound class have been discovered, namely myxochelins A, B, C, D, as well as the structurally related hyalachelins A, B, C, and the recently isolated pseudochelin A. Current studies show that myxochelin biosynthesis is not restricted to myxobacteria, as assumed for a long time, but occurs in phylogenetically diverse bacterial groups. In the present thesis, a detailed analysis of the distribution of myxochelin biosynthesis was conducted. Myxochelin A is a potent inhibitor of the human 5-lipoxygenase (5-LOX), an enzyme involved in the biosynthesis of inflammatory mediators, i.e., the leukotrienes. Since the 5-LOX harbors a non-heme iron serving as redox mediator during catalysis, the question arose if the inhibition of this enzyme is due to the iron-binding capacity of myxochelin A. In order to gain more knowledge about the mode of action, 14 new structural analogues were generated using the precursor-directed biosynthesis approach and their biological activities were evaluated. Furthermore, the biosynthesis of pseudochelin A, a recently discovered myxochelin derivative, was elucidated. Bioinformatic analysis led to the identification of the enzyme, which is responsible for the production of pseudochelin A, namely MxcM, a putative member of the amidohydrolase superfamily. In vitro studies with recombinant enzyme confirmed that MxcM catalyzes the conversion of myxochelin B to pseudochelin A. Subsequently, the in vivo functionality of MxcM was evaluated using the myxobacterium Myxococcus xanthus. The heterologous expression was not based on chromosomal integration of the target gene. Instead a stable expression vector was designed and introduced into M. xanthus, a hitherto unprecedented procedure. Thus, two different expression strains were generated, which were able to produce pseudochelin A additionally to myxochelin A and B. Except for their biosynthesis, the question concerning the biological role of myxochelins was addressed as well. Although it is generally accepted that they act as siderophores, some natural myxochelin derivatives were found to possess rather low iron affinities. In this context several theories about further biological functions of the myxochelins have been discussed, e.g. as regulators of the lipoxygenase activities or as signal molecules involved in intercellular communication of the myxobacteria. In order to test a direct influence of the myxochelins on the morphology, the growth or the development of multicellular swarms of myxobacteria, a M. xanthus mutant strain harboring a disturbed myxochelin biosynthesis pathway was created. Interestingly, the mutant strain was not showing any growth defects, but the morphology of its swarm was significantly altered compared to the wildtype strain.

Browse

Recent Submissions