Strukturbasierte Entwicklung und Evaluierung von Sondenmolekülen zur allosterischen Regulation von Isoformen der Proteinkinase Akt

Abstract

Als zentraler negativer Regulator der Apoptose ist die Proteinkinase Akt mit ihren drei Isoformen (Akt1/Akt2/Akt3) entscheidend für das Überleben der Zelle und eine Schlüssel-Zielstruktur in der Wirkstoffforschung. Für ein anhaltendes Scheitern klinischer Akt Wirkstoff-Kandidaten im Kontext der gezielten Krebstherapie mag der Mangel an Informationen über die Akt Isoformen und ihrer pathophysiologischen Rolle in humanen Krankheitsbildern mitverantwortlich sein. Das komplexe Netzwerk der homologen Proteinkinasen konnte bislang anhand von molekular-biologischen Methoden nicht eindeutig aufgelöst werden. Einschnitte in das Interaktom durch genetische Entfernung von Akt ist überschattet durch Redundanzen der anderen homologen Isoform oder mögliche Kompensierungsprozesse über alternative Signalwege. Es bedarf einer gezielten temporalen Kontrolle der Funktionen ebendieser Enzyme, um verknüpft Interaktionsprofile in einer physiologisch-relevanten Zeitskala zu evaluieren. Diese Pertubationsstudien können elementare Grundsteine für neue innovative therapeutische Ansätze liefern sowie dabei helfen, toxische Nebenwirkungen der bisher bekannten Wirkstoffe einzuordnen und diese Vorteile in vielversprechende Behandlungsstrategien zu übersetzen. Die allosterische Adressierung einer Interdomänen-Bindetasche in Akt mit pharmakologisch-vorteilhaften kovalenten Liganden erwies sich als äußerst vielversprechend. Besonders in Bezug auf Affinität und Selektivität gegenüber ATP-kompetitiven Inhibitoren. Bereits identifizierte allosterische Verbindungen wiesen ein interessantes Selektivitätsprofil gegenüber den Akt Isoformen auf, welches in Kombination mit einer irreversiblen Alkylierungs-Strategie deutlich verbessert werden konnte. Ausgehend von diesen Einblicken in die Struktur-Aktivitätsbeziehung der jeweiligen vermeintlich Isoform-selektiven Liganden sollten weitere Optimierungen durchgeführt werden, um sehr potente, funktionelle Sondenmoleküle zu gewinnen. Die eingeschränkte Verfügbarkeit von Akt2 und Akt3 Kristallstrukturen konnte mithilfe von Homologiemodellen und detailliertem Sequenzvergleich überwunden werden, um grundlegende Informationen für ein gezieltes Design allosterischer Liganden zu erlangen. Aus den modell-abgeleiteten Bedingungen wurde eine Substanzbibliothek strukturbasiert entworfen und unter Verwendung effizienter synthetischer Strategien umgesetzt. Auf Basis von 50 kovalent-allosterischen Akt Inhibitoren (CAAI) konnten anhand biochemischer Daten Rückschlüsse auf die Struktur-Aktivitätsbeziehung der Liganden gezogen werden. Infolgedessen gelang eine detaillierte Aufschlüsselung von vermeintlichen Bindepräferenzen der allosterischen Akt Isoform-Bindetaschen samt Offenlegung umfangreicher Selektivitätsprofilen der Inhibitoren. Ferner konnten die irreversiblen Eigenschaften der kovalenten Verbindungen ergründet sowie neue strukturelle Einblicke in die Protein-Ligand-Wechselwirkung mithilfe von Röntgenstrukturanalyse gewonnen werden. Weiterführend konnten die biochemisch erfassten Selektivitätsprofile der Inhibitoren in ein Akt-Isoform abhängiges Zellsystem übersetzt werden, welches es erlaubt, im Hochdurchsatz und ohne Einschränkung durch gewebsspezifische Expressionslevel die Aktivität der Liganden zu bewerten. Außerdem ermöglichte die Identifizierung von Inhibitoren mit optimalen Selektivitätsfenstern im Ba/F3-Modell-Systemen tiefergehende Studien mit der komplexeren Krebszelllinie PANC1. Daraus resultierte die Ergründung von vorteilhaften Inhibitor-Konzentrationen, welche eine selektive Adressierung der jeweiligen Akt Isoform in zellulären Systemen gewähren. Darüber hinaus konnten in dieser Arbeit funktionalisierte Alkin-Sonden aus den Akt2-selektive Pyrazinon CAAIs gewonnen werden. Als proof-of-concept glückte in ersten in gel Fluoreszenz-Studien die gezielte Modifizierung der Alkin-Funktionalität über eine Kupfer-vermittelte Click-Reaktion mit einem Fluorophor. Diesen chemischen Werkzeugen vermag es gelingen, die Funktionen der Akt Isoformen in komplexen Systemen zu entschlüsseln und ihre Aufgabe in pathophysiologischen Zusammenhängen aufzuklären. Neben der elementaren Rolle in funktionellen Studien stellen die erarbeiteten selektiven Liganden potentielle Wirkstoff-Vorläufer dar, die ein hohes Potenzial besitzen Teil einer innovativen Lösung zur erfolgreichen Adressierung der Proteinkinase Akt und ihrer Isoformen im klinischen Kontext zu sein.