Medizinische Chemie und Chemische Biologie

Permanent URI for this collection

http://hdl.handle.net/2003/36337

Browse

Now showing 1 - 20 of 30

Konzeptionierung und Etablierung von zwei divergierenden Ansätzen zur Beschleunigung der akademischen und industriellen Wirkstoffentwicklungskaskade
(2024) Warmuth, Jonas Damian; Rauh, Daniel; Beck, Michael Edmund
Seit den 1980er Jahren versucht die Pharmaindustrie, den Wirkstoffentwicklungsprozess durch Computer- und Automatisierungstechnologien effizienter zu gestalten. Trotz dieser Bemühun¬gen erweist sich die Medikamentenforschung heute paradoxerweise langwieriger und kostspieliger als vor 40 Jahren. Dieses Phänomen wird als Eroom-Gesetz bezeichnet und er¬schwert die Entwicklung neuer Therapeutika erheblich. Angesichts der stetig zunehmenden Anzahl neu entdeckter pathologischer Erkrankungsmuster und globaler Gesundheitskrisen, wie Pandemien oder die Verbreitung multiresistenter Keime, ist es dringend erforderlich, den Wirk-stoffentwicklungsprozess schneller und risikofreier zu gestalten. Vor dem Hintergrund dieser Herausforderungen wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit in zwei Forschungsprojekten voneinander unabhängige Strategien entwickelt, um die Entwick¬lungskaskade der Pharmaforschung zu beschleunigen und das Eroom-Gesetz zu durchbrechen. Als ein wesentliches Hindernis in der Pharmaforschung gilt unter anderem der langsame und mangelnde Einzug innovativer Synthesetechniken in die Medizinalchemie. Dieser Umstand be-günstigt neben der limitierten Generierung neuer chemischer Materie auch eine regelrechte Verarmung des chemischen und biodiversen Raums innerhalb von Substanzbibliotheken. Mit der Etablierung des sogenannten FRAGTORY-Workflows konnte sich im Zuge des ersten For-schungsprojekts dieser Problematik jedoch angenommen werden. Neben der computerchemischen Konzeptionierung des quelloffenen, modular-aufgebauten und somit je¬derzeit erweiterbaren Arbeitsablaufs stand im Fokus der Forschungsbemühungen auch die experimentelle Etablierung zweier Synthesemethoden, die zum Zeitpunkt des Verfassens dieser Arbeit als tendenziell unterrepräsentiert in der Medizinalchemie angesehen werden konnten. Im Gegensatz zu den konventionellen Designstrategien kommerziell-erhältlicher Bibliotheken, fo¬kussiert sich der FRAGTORY-Ansatz auf die Generierung sp3-reicher Fragmente vor dem Hintergrund einer rekursiven Pharmakophor-Analyse bereits vorhandener Bibliotheksvertreter. Diese Vorgehensweise ermöglicht den dynamischen Abgleich des bereits abgedeckten Pharma¬kophor-Raums und bietet damit Möglichkeit, Synthesekandidaten zu nominieren, die die entstehenden Lücken im chemischen Raum effektiv ausfüllen können. In diesem Kontext konnte zudem auch die experimentelle Einbindung einer Eintopfreaktion zur Darstellung von 2-(Hydroxymethyl)morpholinen sowie einer oxa-DIELS-ALDER-Reaktion für die Generierung von α,β-ungesättigten Pyranonen und Dehydrocineolen Restriktionen bezüg¬lich des zuvor definierten Substratumfangs sowie der Tolerierbarkeit gegenüber der Variation von Reaktionsbedingungen aufdecken. Dies ermöglichte schließlich auch die Ableitung empirischer Reaktivitätsregeln, welche für die spezifische Filterung des zugänglichen synthetischen chemischen Raums genutzt werden konn¬ten. Damit stellt der FRAGTORY-Workflow vor allem für die frühe Phase der Wirkstoffentwicklung ein probates Mittel zur Effizienzsteigerung dar und kann aufgrund seiner Modularität auch problemlos auf anspruchsvolle industrielle Applikationen angewandt werden. Für die Entwicklung von Wirkstoffen zur Behandlung Seltener Krebserkrankungen stellt sich ein klassisches Vorgehen im Sinne einer vorwärtsgerichteten Pharmakologie hingegen aufgrund der häufig undurchsichtigen Datenlage, auftretenden Resistenzmutationen nach Gabe eines wirk¬samen Inhibitors sowie den geringen Fallzahlen und den damit verbundenen mangelnden finanziellen Anreiz für Pharmaunternehmen als unattraktiv dar. Die Behandlung von Patienten mit resistenzerworbenen gastrointestinalen Stromatumoren stellt ein Paradebeispiel für eine sol¬che medizinische Notlage dar, da bisher etablierte Behandlungsoptionen sich entweder als ineffektiv erweisen oder intolerierbare Nebenwirkungen hervorrufen. Für solche Fälle haben sich insbesondere sogenannte strukturbasierte Repositionierungsansätze als attraktive Möglich¬keit bewährt, den Prozess der Wirkstoffentwicklungskaskade zu verkürzen und somit auch im akademischen Umfeld zu ermöglichen. Im Rahmen des zweiten Forschungsprojekts wurde daher im Zuge eines interdisziplinären Forschungs¬zusammenschlusses mit dem WESTDEUTSCHEN TUMORZENTRUM (WTZ), dem Max-Planck-Institut Dortmund zugehörigen COMPOUND MANAGEMENT AND SCREENING CENTER (COMAS) und dem LEAD DISCOVERY CENTER (LDC) in Dortmund, zunächst ein phä¬notypisches Hochdurchsatz-Screening (HTS) mit Hilfe von patienten-erschlossenen isogenen Zelllinienmodellen durchgeführt. Dabei wurden mehrere vielversprechende Treffermoleküle identifiziert, von denen eines aufgrund seiner hohen Potenz gegenüber einer Vielzahl von Muta¬tionen der Onkogene c-KIT und PDGFRα einer biochemischen Validierung unterzogen und durch strukturbasierte chemische Modifikation weiter optimiert wurde. Dabei dienten experimentell bestimmte Kristallstrukturen des Inhibitors im Komplex mit mu¬tiertem PDGFRα als Grundlage weiterer rationaler Modifikationen. Die Synthese einer umfangreichen Substanzbibliothek ermöglichte weiterhin die Herleitung umfangreicher und ra¬tional-erklärbarer Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) und Struktur-Pharmakokinetik-Beziehungen (SPR). In einem abschließend durchgeführten Hybridisierungs-ansatz konnte so¬mit schließlich ein Inhibitor erhalten werden, der im Vergleich zum Ursprungsmolekül verbesserte Selektivitäs- und PK-Eigenschaften aufweist und somit optimale Voraussetzungen für eine Weiterentwicklung zu einem potentiellen klinischen Kandidaten bie¬tet.
Struktur-basiertes Design, Synthese und Charakterisierung von Wirkstoffen zur kovalent-allosterischen Adressierung der Proteinkinase Akt
(2024) Brandherm, Sven; Rauh, Daniel; Summerer, Daniel
Die Ser/Thr-Kinase Akt (Proteinkinase B) ist ein zentraler Regulator im PI3K/Akt/mTOR-Signalnetzwerk, der am häufigsten aktivierten Signalkaskade bei malignen humanen Erkrankungen. Die durch Akt vermittelte Signaltransduktion stellt einen wesentlichen Bestandteil grundlegender physiologischer Prozesse dar, zu denen Zellproliferation, Überleben, Stoffwechsel und Proteinbiosynthese zählen. Veränderungen in den Akt-regulierenden Proteinen wie PI3K und PTEN können zu einer Akt-Hyperaktivität führen und die Genese verschiedene Krankheiten begünstigt, darunter Brust-, Eierstock-, Darm- und Prostatakrebs, Diabetes sowie neurodegenerative Erkrankungen. Ebenso können diese bösartigen Erkrankungen mit der Überexpression der AKT-Gene oder der seltenen Akt1E17K-Mutation in assoziiert werden, welche zu einer konstitutiven Aktivierung des Enzyms führt. In diesem Kontext wurde Akt als ein vielversprechendes Ziel für die Präzisionsmedizin identifiziert. Obwohl die Entwicklung von Akt-Inhibitoren mehr als zwei Jahrzehnte andauert, hat lediglich der ATP-kompetitive Inhibitor Capivasertib in einer Phase III Studie als Ergänzung zu einer Fulvestrant-basierten Therapie bei fortgeschrittenem Brustkrebs vielversprechende Ergebnisse gezeigt und ist bislang der einzige Akt-Inhibitor, der eine Zulassung durch die FDA erhielt. Neben orthosterischen Akt-Inhibitoren wurden auch allosterische Liganden entwickelt, die an der Schnittstelle zwischen der regulatorischen PH-Domäne und der katalytischen Kinasedomäne mit einer einzigartig Bindungstasche interagieren und so eine hochselektive Inhibition von Akt ermöglichen. Allerdings sind alle klinischen Studien im onkologischen Kontext mit allosterischen Akt-Inhibitoren bislang gescheitert, hauptsächlich aufgrund unzureichender Wirksamkeit oder dosislimitierender Toxizität. Um die inhärenten Beschränkungen der ersten Generation von Akt-Inhibitoren zu überwinden, hat die AG RAUH eine innovative Strategie für die gezielte Adressierung von Akt durch kovalent-allosterische Akt-Inhibitoren (CAAIs) entwickelt. Diese Kategorie von Inhibitoren ist so konzipiert, dass sie die einzigartige allosterische Bindungstasche in Akt adressiert und dadurch eine außergewöhnliche Aktivität und Selektivität gewährleistet. Darüber hinaus alkylieren CAAIs Cysteinseitenketten in der Aktivierungsschleife von Akt, wodurch die Verweildauer am Zielprotein maximiert und somit die pharmakodynamische Wirkung verstärkt wird. Die pharmakokinetische Evaluation des Prototypen-CAAIs Borussertib ergab jedoch ein optimierungsbedürftiges Profil, das durch eine unzureichende Löslichkeit und Permeabilität und damit eine eingeschränkte Bioverfügbarkeit beschrieben werden kann. Diese Arbeit beschreibt das Struktur-basierte Design, die Synthese und die umfassende Charakterisierung neuartiger, kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren und Sondenmoleküle. Die Analyse verfügbarer Co-Kristallstrukturen der in der AG RAUH entwickelten CAAIs sowie von Bindungsmodellen, die auf literaturbekannten allosterischen Akt-Inhibitoren basieren, führte zur Konzeption neuartiger potentiell kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren. Infolgedessen wurde eine konvergente Synthesestrategie entwickelt, die es ermöglichte, potentielle CAAIs auf der Grundlage eines westlichen Molekülbausteins, der von einem Pharmakophor mit gemeinsamen Merkmalen aus literaturbeschriebenen allosterischen Akt-Inhibitoren abgeleitet wurde, und eines östlichen Molekülbausteins, der bereits für den Prototyp Borussertib entwickelt wurde, darzustellen. Die Syntheseroute ermöglichte die Derivatisierung der Verbindungen in einem späten Schritt, was zur erfolgreichen Synthese von insgesamt 24 Derivaten führte. Das Ziel der ersten Serie neuartiger CAAIs bestand darin, geeignete Substitutionsmuster zu identifizieren, die sich durch eine gute in vitro Potenz sowie verbesserte PK-Eigenschaften auszeichnen. Alle getesteten Verbindungen zeigten während der biochemischen Charakterisierung ein bemerkenswertes Inhibitionspotential gegenüber den drei Akt-Isoformen, was auf einen kovalenten Bindungsmodus hindeutet, der anschließend durch kinetische und massenspektrometrische Experimente bestätigt werden konnte. Zelluläre Untersuchungen ausgewählter Verbindungen ergaben eine konzentrationsabhängige Herunterregulation von pAkt1 und pAkt2 sowie deren nachgestellten Substraten, die bereits bei geringeren Konzentrationen im Vergleich zu klinischen Kandidaten beobachtet wurden. Im Zuge der pharmakokinetischen Charakterisierung zeigte sich, dass acht der neu entwickelten CAAIs im Caco-2-Assay eine signifikant geringere Effluxrate im Vergleich zum Prototyp Borussertib und somit eine verbesserte intestinale Permeabilität aufwiesen. Für den Großteil der neuen Verbindungen konnte eine exzellente Stabilität in Anwesenheit von murinen Lebermikrosomen sowie eine hinreichend gute Stabilität in Gegenwart von Glutathion nachgewiesen werden. In Anbetracht des überdurchschnittlich hohen Molekulargewichts und der Lipophilie der Verbindungen führten die Analysen der Löslichkeit jedoch lediglich zu moderaten Resultaten. Mit der erfolgreichen Strukturaufklärung wurde der Grundstein für einen zweiten Zyklus des SBDD gelegt. Basierend auf den elf neuen Co-Kristallstrukturen wurden weitere Derivate konzipiert und synthetisiert. Hier führte das Bestreben zum Design einer verbesserten Serie von CAAIs, wobei der Schwerpunkt auf der Optimierung der Pharmakokinetik und der Ligandeneffizienz lag. Insgesamt wurden 30 Derivate synthetisiert, die sich durch ihr meta-Substitutionsmuster im westlichen Molekülteil, sowie durch Variationen der östlichen Molekülbausteine und des reaktiven warhead unterscheiden. Die biochemische Evaluation ergab für Verbindungen mit konventionellem Acrylamid-warhead eine Präferenz für die Inhibition von Akt1 und Akt2 gegenüber Akt3. Im Gegensatz dazu zeigten Verbindungen mit 2-Fluoracrylamid-Warhead eine höhere Selektivität für Akt1 gegenüber Akt2 und Akt3. In zellulären Untersuchungen erreichten zwei der neuen CAAIs eine subnanomolare Hemmung der Brustkrebszelllinie ZR-75-1, was den ersten Fall einer derart hohen anti-proliferativen Aktivität aller bisher entwickelten CAAIs darstellt. Detaillierte Western-Blot-Analysen einer ausgewählten Serie von Verbindungen zeigten eine konzentrationsabhängige Herunterregulierung von pAkt1, pAkt2 und deren nachgeschalteter Substrate bei geringeren Konzentrationen im Vergleich zu den klinischen Kandidaten Capivasertib und Miransertib. Eine schlüssige in vitro PK-Studie offenbarte eine akzeptable kinetische Löslichkeit für 13 der 28 getesteten Derivate, wobei Liganden mit α-fluorierten Acrylamiden die vielversprechendsten Ergebnisse lieferten. Die Mehrzahl der CAAIs wies eine murine Plasmastabilität von > 90% auf, wobei fünf Inhibitoren eine geringe intrinsische clearance und eine außergewöhnliche Resistenz gegenüber konjugierenden Enzymen des Phase II-Metabolismus zeigten. Der abschließende Caco-2-Assay indizierte für neun der getesteten CAAIs eine orale Bioverfügbarkeit. Schließlich wurde der frontrunner der neuen Serie einem direkten Vergleich mit klinisch fortgeschrittenen Inhibitoren in einem Brustkrebszellpanel unterzogen, das aus 29 genetisch-annotierten Brustkrebszelllinien bestand. Diese Analyse offenbarte die herausragende Wirksamkeit und Überlegenheit des getesteten CAAI, die auf dem kovalent-allosterischen Wirkmechanismus beruhen. In einer abschließenden Strukturanalyse wurden fünf der neuartigen Inhibitoren mit Akt1 Co-kristallisiert, wobei bisher unbekannte Wechselwirkungen zwischen den Liganden und dem Protein identifiziert werden konnten. In einem weiteren Projekt wurde während der Strukturaufklärung der neuartigen CAAIs eine weitere Disulfidbrücke in der PH-Domäne von Akt1 identifiziert. Die Tatsache, dass es sich bei diesen Cysteinen um redox-sensitive Aminosäuren handelt, die möglicherweise für die Aktivierung von Akt essentiell sind, bildete die Grundlage für die Entwicklung von neuartigen Liganden auf Basis der zuvor dargestellten westlichen Molekülbausteine.Das rationale Design führte zur Synthese eines fokussierten Sets von neun Verbindungen, von denen drei mit einem reaktiven Acrylamid-warhead ausgestattet waren, um die Cysteinseitenketten der PH-Domäne zu adressieren. Die biochemische Charakterisierung dieser potentiell kovalent-allosterischen Akt-Inhibitoren zeigten eine signifikante Steigerung der Potenz gegenüber den drei Akt-Isoformen verglichen mit ihren reversiblen Gegenstücken. Auf zellulärer Ebene resultierte dies in EC50-Werten im niedrigen nanomolaren Bereich. In einer umfassenden Western-Blot-Analyse konnte die konzentrationsabhängige Herunterregulierung von pAkt1 und pAkt2 sowie der Akt-nachgeschalteten Substraten demonstriert werden. Abschließende Strukturaufklärungen bestätigten den antizipierten kovalent-allosterischen Wirkmechanismus und die irreversible Alkylierung einer Cysteinseitenkette in der PH-Domäne von Akt1. Zusätzlich erlaubte die Verwendung eines Akt2-Mimikrykonstrukts einen einzigartigen Einblick in die allosterische Interdomänen-Bindungstasche von Akt2. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden auf Grundlage der zuvor entwickelten CAAIs drei Biotin-konjugierte Sondenmoleküle entworfen und synthetisiert, welche die Grundlage zur Etablierung eines Akt-gerichteten target occupancy Assays bilden. In initialen zellulären Studien konnte trotz des hohen Molekulargewichts der Sonden, die Zellgängigkeit demonstriert werden. Zur Validierung der Funktion als selektive Sonden für Akt wurde schließlich eine Reihe von immunologischen Western-Blot-Analysen durchgeführt. Durch Inkubation sowohl von Zelllysaten als auch von lebenden Zellen in Gegenwart dieser Sondenmoleküle konnte die konzentrationsabhängige und selektive Markierung von Akt durch die dargestellten Sondenmoleküle nachgewiesen werden. Ebenso konnte in kompetitiven Ansätzen mit allosterischen und kovalent-allosterischen Akt-Inhibitoren eine konzentrationsabhängige Verdrängung der Referenzverbindungen beobachtet werden.
Avapritinib-based SAR studies unveil a binding pocket in KIT and PDGFRA
(2024-01-02) Teuber, A.; Schulz, T.; Fletcher, B. S.; Gontla, R.; Mühlenberg, T.; Zischinsky, M.-L.; Niggenaber, J.; Weisner, J.; Kleinbölting, S. B.; Lategahn, J.; Sievers, S.; Müller, M. P.; Bauer, S.; Rauh, D.
Avapritinib is the only potent and selective inhibitor approved for the treatment of D842V-mutant gastrointestinal stromal tumors (GIST), the most common primary mutation of the platelet-derived growth factor receptor α (PDGFRA). The approval was based on the NAVIGATOR trial, which revealed overall response rates of more than 90%. Despite this transformational activity, patients eventually progress, mostly due to acquired resistance mutations or following discontinuation due to neuro-cognitive side effects. These patients have no therapeutic alternative and face a dismal prognosis. Notable, little is known about this drug’s binding mode and its medicinal chemistry development, which is instrumental for the development of the next generation of drugs. Against this background, we solve the crystal structures of avapritinib in complex with wild-type and mutant PDGFRA and stem cell factor receptor (KIT), which provide evidence and understanding of inhibitor binding and lead to the identification of a sub-pocket (Gα-pocket). We utilize this information to design, synthesize and characterize avapritinib derivatives for the determination of key pharmacophoric features to overcome drug resistance and limit potential blood-brain barrier penetration.
Covalent allosteric inhibitors of Akt generated using a click fragment approach
(2022-02-16) Westhuizen, Leandi van der; Weisner, Jörn; Taher, Abu; Landel, Ina; Quambusch, Lena; Lindemann, Marius; Uhlenbrock, Niklas; Müller, Matthias P.; Green, Ivan R.; Pelly, Stephen C.; Rauh, Daniel; Otterlo, Willem A. L. van
Akt is a protein kinase that has been implicated in the progression of cancerous tumours. A number of covalent allosteric Akt inhibitors are known, and based on these scaffolds, a small library of novel potential covalent allosteric imidazopyridine-based inhibitors was designed. The envisaged compounds were synthesised, with click chemistry enabling a modular approach to a number of the target compounds. The binding modes, potencies and antiproliferative activities of these synthesised compounds were explored, thereby furthering the structure activity relationship knowledge of this class of Akt inhibitors. Three novel covalent inhibitors were identified, exhibiting moderate activity against Akt1 and various cancer cell lines, potentially paving the way for future covalent allosteric inhibitors with improved properties.
Design and synthesis of Nrf2-derived hydrocarbon stapled peptides for the disruption of protein-DNA-interactions
(2022-06-22) Wiedemann, Bianca; Kamps, Dominic; Depta, Laura; Weisner, Jörn; Cvetreznik, Jana; Tomassi, Stefano; Gentz, Sascha; Hoffmann, Jan-Erik; Müller, Matthias P.; Koch, Oliver; Dehmelt, Leif; Rauh, Daniel
Misregulation and mutations of the transcription factor Nrf2 are involved in the development of a variety of human diseases. In this study, we employed the technology of stapled peptides to address a protein-DNA-complex and designed a set of Nrf2-based derivatives. Varying the length and position of the hydrocarbon staple, we chose the best peptide for further evaluation in both fixed and living cells. Peptide 4 revealed significant enrichment within the nucleus compared to its linear counterpart 5, indicating potent binding to DNA. Our studies suggest that these molecules offer an interesting strategy to target activated Nrf2 in cancer cells.
Design, Synthese und Evaluation Mutanten-selektiver Inhibitoren zur Adressierung onkogener KRas-Varianten
(2022) Goebel, Lisa; Rauh, Daniel; Goody, Roger S.
Ras-Proteine fungieren als molekulare Schalter in der Signaltransduktion essentieller zellulärer Prozesse, indem sie zwischen einem inaktiven GDP-gebundenen und einem aktiven GTP-gebundenen Zustand wechseln. Onkogene Ras-Mutationen, die in etwa 25 % aller humanen Krebsarten vorkommen und zu einer Fehlregulation des switch Mechanismus führen sind daher attraktive Zielstrukturen in der Präzisionsmedizin. Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung nach Entdeckung der Ras-Onkogene im Jahre 1981 waren Versuche, Ras gezielt zu adressieren, weitestgehend erfolglos und Ras-Proteine galten lange Zeit als nicht adressierbar (engl.: undruggable). Neue Hoffnung ergab sich jedoch im Jahr 2013 durch die erfolgreiche gezielte Adressierung der G12CMutation von Ras durch Kevan Shokat. Neben kovalenten Inhibitoren, die innerhalb der switch-II-Tasche irreversibel an die G12C-Mutation binden und deren Optimierung schließlich im Mai 2021 zur Zulassung des ersten KRasG12C-Inhibitors Sotorasib (Amgen) für die Behandlung von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) führte, wurden zudem Nukleotid-kompetitive Inhibitoren entwickelt, die ebenfalls kovalent an KRasG12C binden können. Strategien, die eine direkte Konkurrenz zur Nukleotidbindung beinhalten, wurden ursprünglich aufgrund der hohen Affinität von GDP/GTP für Ras und der hohen zellulären Nukleotid-Konzentrationen verworfen, erlangten jedoch durch die Kombination mit einem kovalenten Wirkmechanismus der Inhibitoren erneut Aufmerksamkeit im akademischen Umfeld. Die dabei am β-Phosphat der GDP-Derivate eingeführten elektrophilen Gruppen führten jedoch zu einer dramatischen Reduzierung der reversiblen Bindungsaffinität der Nukleotidderivate, da wichtige Wechselwirkungen mit dem Protein und dem Mg2+-Ion verloren gehen. Um diese Limitierung zu überwinden und diesen Ansatz der kovalenten Nukleotid-kompetitiven Inhibitoren an onkogene KRas-Varianten mit Cysteinen im P-loop (KRasG12C und KRasG13C) anzupassen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mittels strukturbasiertem Wirkstoffdesign Nukleotidanaloga synthetisiert, die einen Thiolreaktiven Linker an den 2‘,3‘-OH-Gruppen der Ribose für eine kovalente Proteinmodifikation tragen. Anhand von massenspektrometrischen Experimenten konnte gezeigt werden, dass die dargestellten Nukleotidderivate selektiv an KRasG13C binden, ohne dabei KRasG12C sowie KRasWT zu adressieren. Mittels einer detaillierten kinetischen Charakterisierung wurden anschließend die Affinitäten der Nukleotidanaloga gegenüber KRas im Vergleich zu den unmodifizierten Nukleotiden bestimmt. Neben der Bestimmung der Kinetik der Nukleotidassoziation (kon) mit einer bereits etablierten stopped-flow Methode wurde im Rahmen dieser Arbeit zudem ein HPLC-basierter Assay zur Evaluierung der relativen Affinitäten der Nukleotidanaloga entwickelt. Die Affinitäten der dargestellten Nukleotidderivate sind dabei mit denen der unmodifizierten Nukleotide vergleichbar, sodass der eingeführte Linker keinen Einfluss auf die reversible Wechselwirkung und die Affinität hat, was bei einem Nukleotid-kompetitivem Ansatz von maßgeblicher Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass bei KRasG13C, welches eine drastisch erhöhte intrinsische Nukleotidaustauschrate im Vergleich zum WT besitzt, infolge einer kovalenten Proteinmodifikation der SOS-katalysierter Nukleotidaustausch verhindert und kovalent modifiziertes KRasG13C im inaktiven Zustand stabilisiert wird. Eine gesteigerte GTP-Hydrolyse in Gegenwart von GAPs konnte für kovalent modifizierte KRasG13C im Vergleich zu KRasWT nicht beobachtet werden, die intrinsische GTP-Hydrolyse ist hingegen vergleichbar mit der von KRasWT. Die in dieser Arbeit generierten Komplexkristallstrukturen von KRasG13C-edaGDP und KRasG13C-bdaGDP ermöglichten darüber hinaus einen detaillierten Einblick in den Bindemodus der Nukleotidderivate und bestätigten den erwarteten Bindemodus sowie die kovalente Bindungsknüpfung an Cys13. Aufgrund der limitierten Verfügbarkeit von KRasG13C-abhängigen Krebszelllinien wurden zunächst erfolgreich artifizielle KRas-abhängige Zelllinien, darunter NIH-3T3 sowie Ba/F3-Zellen generiert, die in Zukunft für die Charakterisierung mutantenselektiver KRas-Inhibitoren genutzt werden können. Für die zelluläre Charakterisierung der in dieser Arbeit dargestellten Nukleotidanaloga, die aufgrund ihres anionischen Charakters nicht die Zellmembran überwinden können, wurden verschiedene Strategien für den Transfer in Zellen getestet, unter anderem ein NTP-Transporter vermittelter Transfer sowie die Elektroporation. Durch Elektroporation rekombinanter KRas-Proteine in Zellen konnte schließlich gezeigt werden, dass bei der Verwendung von kovalent modifiziertem KRasG13C eine onkogene Signalweiterleitung in vivo inhibiert wird, was die Möglichkeit des Einsatzes von kovalenten Nukleotid-basierten Inhibitoren bei KRasG13C-getriebenem Krebs verdeutlicht.
Strukturbiologische und zelluläre Charakterisierung Isoform-selektiver kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren
(2022) Depta, Laura; Rauh, Daniel; Dehmelt, Leif
Die Proteinkinase Akt, die aus drei Isoformen (Akt1/Akt2/Akt3) besteht, ist ein zentraler Knotenpunkt innerhalb des PI3K/Akt/mTOR-Signalwegs. Genomische Veränderungen wie aktivierende Mutationen in PI3K und Amplifikationen von AKT-Genen können eine Überaktivierung der Akt-Isoformen und damit einhergehend verschiedene Krankheiten auslösen. Trotz intensiver Forschung in den letzten Jahrzehnten sind mehrere klinische Studien mit potenziellen Arzneimittelkandidaten gescheitert. Verantwortlich dafür sind u. a. der Mangel an Informationen über Isoform-spezifische Funktionen im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten sowie die nicht selektive Adressierung der Isoformen und die damit verbundenen Nebenwirkungen. In dieser Arbeit war das Hauptziel, strukturbiologische und zelluläre Systeme zu etablieren, die die Grundlage für ein strukturbasiertes Wirkstoffdesign von Isoform-selektiven kovalent-allosterischen Akt-Inhibitoren (CAAIs) bilden. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein detaillierter Sequenz- und Strukturvergleich der Akt-Isoformen durchgeführt. Die Strukturanalyse und ein fundiertes Konstruktdesign ermöglichten die Entwicklung effizienter Expressions- und Reinigungsstrategien. Weiterhin konnte im Rahmen von Kristallisationsstudien ein einzigartiger Einblick in die Akt2-Bindungstasche gewonnen werden, indem diese in Akt1 nachgebildet wurde. Dieser Einblick, kombiniert mit biochemischen und massenspektrometrischen Daten, ermöglichte eine Evaluierung einer fokussierten Substanzbibliothek und eine Verifizierung des von einem Homologiemodell abgeleiteten CAAI-Designansatzes. Um weiterführende zelluläre Studien zu ermöglichen, wurde ein Ba/F3-Akt-Isoform-abhängiges Modellsystem etabliert. Mit Hilfe dieses Modellsystems konnten biochemische Selektivitätsprofile der fokussierten Substanzbibliothek erstmalig in den zellulären Kontext übertragen werden und dienten als Grundlage für weitere Studien an der menschlichen Krebszelllinie PANC1. Darueber hinaus zeigten zellulären Studien an Akt-knock-out-Modellen die Vorteile der Isoform-selektiven CAAIs gegenüber invasiven genetischen knock-outs für die Entschlüsselung der Isoform-spezifischen Funktionen von Akt.
Scanning protein surfaces with DNA-encoded libraries
(2020-12-09) Kunig, Verena B. K.; Potowski, Marco; Klika Škopić, Mateja; Brunschweiger, Andreas
Understanding the ligandability of a target protein, defined as the capability of a protein to bind drug-like compounds on any site, can give important stimuli to drug-development projects. For instance, inhibition of protein–protein interactions usually depends on the identification of protein surface binders. DNA-encoded chemical libraries (DELs) allow scanning of protein surfaces with large chemical space. Encoded library selection screens uncovered several protein–protein interaction inhibitors and compounds binding to the surface of G protein-coupled receptors (GPCRs) and kinases. The protein surface-binding chemotypes from DELs are predominantly chemically modified and cyclized peptides, and functional small-molecule peptidomimetics. Peptoid libraries and structural peptidomimetics have been less studied in the DEL field, hinting at hitherto less populated chemical space and suggesting alternative library designs. Roughly a third of bioactive molecules evolved from smaller, target-focused libraries. They showcase the potential of encoded libraries to identify more potent molecules from weak, for example, fragment-like, starting points.
Towards DNA-encoded micellar chemistry: DNA-micelle association and environment sensitivity of catalysis
(2021-05-12) Klika Škopić, Mateja; Gramse, Christian; Oliva, Rosario; Pospich, Sabrina; Neukirch, Laura; Manisegaran, Magiliny; Raunser, Stefan; Winter, Roland; Weberskirch, Ralf; Brunschweiger, Andreas
The development of DNA-compatible reaction methodologies is a central theme to advance DNA-encoded screening library technology. Recently, we were able to show that sulfonic acid-functionalized block copolymer micelles facilitated Brønsted acid-promoted reactions such as the Povarov reaction on DNA-coupled starting materials with minimal DNA degradation. Here, the impact of polymer composition on micelle shape, and reaction conversion was investigated. A dozen sulfonic acid-functionalized block copolymers of different molar mass and composition were prepared by RAFT polymerization and were tested in the Povarov reaction, removal of the Boc protective group, and the Biginelli reaction. The results showed trends in the polymer structure-micellar catalytic activity relationship. For instance, micelles composed of block copolymers with shorter acrylate ester chains formed smaller particles and tended to provide faster reaction kinetics. Moreover, fluorescence quenching experiments as well as circular dichroism spectroscopy showed that DNA-oligomer-conjugates, although highly water-soluble, accumulated very effectively in the micellar compartments, which is a prerequisite for carrying out a DNA-encoded reaction in the presence of polymer micelles.
Synthese, in vitro und in vivo Evaluierung molekularer Sonden, PROTACs und PET-Tracern zur Adressierung der Proteinkinase Akt
(2022) Lindemann, Marius; Rauh, Daniel; Summerer, Daniel
Tumorerkrankungen stellen weltweit die zweithäufigste Todesursache dar und aufgrund der demographischen Entwicklung nimmt die Anzahl der Neuerkrankungen und Todesfälle stetig zu. Zur Adressierung der Proteinkinase Akt, ein hochrelevantes Protein in der Tumorentstehung, wurde für die präklinische Entwicklung die Hochskalierung eines kovalent-allosterischen Akt Inhibitor (CAAI) durchgeführt. Hiermit konnten in ersten Xenograft-Modellen vielversprechende Ergebnisse erhalten werden. Zur Optimierung der PK-Eigenschaften dieses CAAI wurde der chemische Raum erweitert. Die kleine fokussierte Substanzbibliothek auf Basis eines monozyklischen Pyridins lieferte neue Einblicke in die SAR der CAAIs. Dies ermöglichte das Design und die Synthese eines Akt-spezifischen Radioliganden, welcher in ersten in vivo Tiermodellen ein stabiles radioaktives Signal induzierte und durch weitere Optimierung zur Entwicklung eines PET-Tracers beitragen kann. Zur genaueren Analyse der Tumorbiologie von Akt wurden molekulare Sonden auf Basis der CAAIs entwickelt und in vitro etabliert. Als neuer innovativer Adressierungsansatz konnten erfolgreich die ersten drei Akt-spezifischen allosterischen PROTACs dargestellt werden, die einen Akt1-Abbau in Panc1-Zellen induzierten.
Cellular model system to dissect the isoform-selectivity of Akt inhibitors
(2021-09-06) Quambusch, Lena; Depta, Laura; Landel, Ina; Lubeck, Melissa; Kirschner, Tonia; Nabert, Jonas; Uhlenbrock, Niklas; Weisner, Jörn; Kostka, Michael; Levy, Laura M.; Schultz-Fademrecht, Carsten; Glanemann, Franziska; Althoff, Kristina; Müller, Matthias P.; Siveke, Jens T.; Rauh, Daniel
The protein kinase Akt plays a pivotal role in cellular processes. However, its isoforms’ distinct functions have not been resolved to date, mainly due to the lack of suitable biochemical and cellular tools. Against this background, we present the development of an isoform-dependent Ba/F3 model system to translate biochemical results on isoform specificity to the cellular level. Our cellular model system complemented by protein X-ray crystallography and structure-based ligand design results in covalent-allosteric Akt inhibitors with unique selectivity profiles. In a first proof-of-concept, the developed molecules allow studies on isoform-selective effects of Akt inhibition in cancer cells. Thus, this study will pave the way to resolve isoform-selective roles in health and disease and foster the development of next-generation therapeutics with superior on-target properties.
DNA-kodierte Substanzbibliotheken: Chemische Stabilisierung der DNA, Entwicklung neuer Synthesemethoden und Identifizierung von TEAD-YAP-Inhibitoren
(2021) Kunig, Verena B. K.; Brunschweiger, Andreas; Rauh, Daniel
Die Technologie der DNA-kodierten Substanzbibliotheken (DELs) hat sich in den letzten Jahren als eine vielversprechende Alternative zum Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung kleiner organischer Moleküle, welche mit pharmazeutisch relevanten, biologischen Zielstrukturen interagieren, etabliert. DELs bestehen aus einer Vielzahl an DNA-kodierten Molekülen, welche gleichzeitig in Affinitäts-basierten Selektionsassays gegenüber einer Zielstruktur getestet und im Anschluss anhand ihrer einzigartigen DNA-Sequenz leicht „entschlüsselt“ werden können. Ein Großteil der in der Literatur beschriebenen DELs wird über „split and pool“-Synthesen in wässriger Lösung synthetisiert. Dies hat zur Folge, dass viele gängige Synthesemethoden der organischen Chemie, die auf trockene Lösungsmittel angewiesen sind, nicht für die DEL-Synthese zur Anwendung kommen können. Eine weitere Limitierung zur Herstellung von DELs stellt die Stabilität der DNA gegenüber verschiedenen Reaktionsbedingungen dar. Viele als Katalysatoren standardmäßig in der präparativen organischen Chemie eingesetzte Metallsalze sowie stark saure Reaktionsbedingungen können in der DEL-Synthese nicht verwendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Fokus auf die Synthese von DELs basierend auf einer Festphasenstrategie gelegt. Diese bietet neben der freien Wahl des Lösungsmittels den Vorteil, dass die Nukleobasen der DNA vollständig geschützt vorliegen und somit die gesamte DNA eine höhere Stabilität aufweist. Im ersten Teil der Arbeit wird die Synthese einer Indol-fokussierten DNA-kodierten Substanzbibliothek, ausgehend von dem chemisch sehr stabilen, controlled pore glass (CPG)-gebundenen Hexathymidin („hexT“)-Adapteroligonukleotid beschrieben (thymidine-initiated DNA-encoded chemistry, TIDEC). Die im Vergleich zu anderen DELs recht kleine Bibliothek von 8.112 Molekülen konnte im Selektionsscreening vielversprechende Wirkstoffkandidaten für schwierig zu adressierende Proteine wie dem Transkriptionsfaktor TEAD4 liefern. Das in diesem Verfahren verwendete Adapteroligonukleotid hexT erlaubt jedoch keine Kodierung von Startmaterialien. Diese Einschränkung wird im weiteren Verlauf der Arbeit adressiert durch die Überführung weiterer organischer Synthesemethoden (Ugi-Vierkomponentenreaktion, Ugi-Azid-Vierkomponentenreaktion, Ugi-Vierkomponenten-aza-Wittig-Reaktion, Groebke-Blackburn-Bienaymé-Dreikomponentenreaktion, AgOAc-vermittelte 1,3-dipolare Azomethin-Ylid-Cycloaddition, Yb(PFO)3-vermittelte Dreikomponenten-Pyrazolsynthese) auf ein neues, effizienteres DNA-Kodierungsformat, das den Einsatz von kodierten Startmaterialien ermöglicht. Damit auch harschere Reaktionsbedingungen in der DEL-Synthese verwendet werden können, wird im letzten Teil der Arbeit durch den Austausch der vulnerablen Purinnukleobase Adenin durch die chemisch modifizierte Base 7-Deazaadenin die Etablierung eines chemisch stabilisierten DNA-Barcodes beschrieben.
Strukturbasierte Entwicklung und Evaluierung von Sondenmolekülen zur allosterischen Regulation von Isoformen der Proteinkinase Akt
(2021) Quambusch, Lena; Rauh, Daniel; Czodrowski, Paul
Als zentraler negativer Regulator der Apoptose ist die Proteinkinase Akt mit ihren drei Isoformen (Akt1/Akt2/Akt3) entscheidend für das Überleben der Zelle und eine Schlüssel-Zielstruktur in der Wirkstoffforschung. Für ein anhaltendes Scheitern klinischer Akt Wirkstoff-Kandidaten im Kontext der gezielten Krebstherapie mag der Mangel an Informationen über die Akt Isoformen und ihrer pathophysiologischen Rolle in humanen Krankheitsbildern mitverantwortlich sein. Das komplexe Netzwerk der homologen Proteinkinasen konnte bislang anhand von molekular-biologischen Methoden nicht eindeutig aufgelöst werden. Einschnitte in das Interaktom durch genetische Entfernung von Akt ist überschattet durch Redundanzen der anderen homologen Isoform oder mögliche Kompensierungsprozesse über alternative Signalwege. Es bedarf einer gezielten temporalen Kontrolle der Funktionen ebendieser Enzyme, um verknüpft Interaktionsprofile in einer physiologisch-relevanten Zeitskala zu evaluieren. Diese Pertubationsstudien können elementare Grundsteine für neue innovative therapeutische Ansätze liefern sowie dabei helfen, toxische Nebenwirkungen der bisher bekannten Wirkstoffe einzuordnen und diese Vorteile in vielversprechende Behandlungsstrategien zu übersetzen. Die allosterische Adressierung einer Interdomänen-Bindetasche in Akt mit pharmakologisch-vorteilhaften kovalenten Liganden erwies sich als äußerst vielversprechend. Besonders in Bezug auf Affinität und Selektivität gegenüber ATP-kompetitiven Inhibitoren. Bereits identifizierte allosterische Verbindungen wiesen ein interessantes Selektivitätsprofil gegenüber den Akt Isoformen auf, welches in Kombination mit einer irreversiblen Alkylierungs-Strategie deutlich verbessert werden konnte. Ausgehend von diesen Einblicken in die Struktur-Aktivitätsbeziehung der jeweiligen vermeintlich Isoform-selektiven Liganden sollten weitere Optimierungen durchgeführt werden, um sehr potente, funktionelle Sondenmoleküle zu gewinnen. Die eingeschränkte Verfügbarkeit von Akt2 und Akt3 Kristallstrukturen konnte mithilfe von Homologiemodellen und detailliertem Sequenzvergleich überwunden werden, um grundlegende Informationen für ein gezieltes Design allosterischer Liganden zu erlangen. Aus den modell-abgeleiteten Bedingungen wurde eine Substanzbibliothek strukturbasiert entworfen und unter Verwendung effizienter synthetischer Strategien umgesetzt. Auf Basis von 50 kovalent-allosterischen Akt Inhibitoren (CAAI) konnten anhand biochemischer Daten Rückschlüsse auf die Struktur-Aktivitätsbeziehung der Liganden gezogen werden. Infolgedessen gelang eine detaillierte Aufschlüsselung von vermeintlichen Bindepräferenzen der allosterischen Akt Isoform-Bindetaschen samt Offenlegung umfangreicher Selektivitätsprofilen der Inhibitoren. Ferner konnten die irreversiblen Eigenschaften der kovalenten Verbindungen ergründet sowie neue strukturelle Einblicke in die Protein-Ligand-Wechselwirkung mithilfe von Röntgenstrukturanalyse gewonnen werden. Weiterführend konnten die biochemisch erfassten Selektivitätsprofile der Inhibitoren in ein Akt-Isoform abhängiges Zellsystem übersetzt werden, welches es erlaubt, im Hochdurchsatz und ohne Einschränkung durch gewebsspezifische Expressionslevel die Aktivität der Liganden zu bewerten. Außerdem ermöglichte die Identifizierung von Inhibitoren mit optimalen Selektivitätsfenstern im Ba/F3-Modell-Systemen tiefergehende Studien mit der komplexeren Krebszelllinie PANC1. Daraus resultierte die Ergründung von vorteilhaften Inhibitor-Konzentrationen, welche eine selektive Adressierung der jeweiligen Akt Isoform in zellulären Systemen gewähren. Darüber hinaus konnten in dieser Arbeit funktionalisierte Alkin-Sonden aus den Akt2-selektive Pyrazinon CAAIs gewonnen werden. Als proof-of-concept glückte in ersten in gel Fluoreszenz-Studien die gezielte Modifizierung der Alkin-Funktionalität über eine Kupfer-vermittelte Click-Reaktion mit einem Fluorophor. Diesen chemischen Werkzeugen vermag es gelingen, die Funktionen der Akt Isoformen in komplexen Systemen zu entschlüsseln und ihre Aufgabe in pathophysiologischen Zusammenhängen aufzuklären. Neben der elementaren Rolle in funktionellen Studien stellen die erarbeiteten selektiven Liganden potentielle Wirkstoff-Vorläufer dar, die ein hohes Potenzial besitzen Teil einer innovativen Lösung zur erfolgreichen Adressierung der Proteinkinase Akt und ihrer Isoformen im klinischen Kontext zu sein.
Biochemische und strukturbiologische Evaluierung von MKK7-Ligand Wechselwirkungen
(2021) Wolle, Patrik; Rauh, Daniel; Brakmann, Susanne
Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Signalwege sind in eukaryotischen Zellen von besonderer Bedeutung, da sie einen zentralen Bestandteil der Weiterleitung von extrazellulären Signalen zum Zellkern darstellen. Beim Menschen sind insgesamt vier MAPK-Signalwege bekannt. In dieser Arbeit wurde im Speziellen der JNK-Signalweg genauer untersucht, der vor allem in Folge von physischen Stimuli wie Hitze, Strahlung und osmotischen Schock sowie Cytokine aktiviert wird. Ebenso ist der JNK-Signalweg in die Entwicklung von Organen während der Embryogenese und in der Entwicklung des Gehirns und des Nervensystems beteiligt. Dies macht den Signalweg zu einem relevanten Ziel für die Wirkstoffforschung. Es konnte bereits gezeigt werden, dass eine direkte Einwirkung auf JNK, zum Beispiel durch selektive JNK-Inhibitoren, viele Nebenwirkungen auslösen kann. Aus diesem Grund sollte in dieser Arbeit die Regulierung eine der beiden Aktivatoren von JNK, die Mitogen aktivierte Protein Kinase Kinase 7 (MKK7), genauer analysiert werden. Hierfür sollte nach Liganden gesucht werden, welche die Aktivität der Kinase innerhalb eines Organismus spezifisch modulieren können, mit dem Ziel, mit Hilfe dieser Substanz Veränderungen in der Funktionsweise des Signalweges, zum Beispiel in den Phosphorylierungsmustern der JNK Substrate, oder in der Morphologie der Zelle, zu detektieren. Dazu wurde zunächst eine Auswahl von verschiedenen biochemischen Assays hinsichtlich ihrer Eignung auf die Charakterisierung von MKK7-Liganden untersucht und mit einem, auf diese Weise identifizierten, geeignetem System eine Bibliothek niedermolekularer Substanzen durchmustert. Die gefundenen Hits wurden sowohl biochemisch als auch mit Hilfe von massenspektrometrischen Messungen validiert. Der potenteste Inhibitor (Verbindung 22) wurde anschließend in Mäusen auf seine pharmakokinetischen Eigenschaften hin untersucht, und in einem Ansatz mit DRG-Zellen auf seine spezifische Wirksamkeit hin untersucht und zeigte auch hier eine hohe Aktivität wie auch Selektivität. Zusätzlich wurde Verbindung 22 wie auch eine Reihe weiterer Inhibitoren im Komplex mit MKK7 kokristallisiert, wodurch der Bindungsmodus dieser Inhibitoren aufgeklärt werden konnte.
Struktur-basiertes Design, Synthese und pharmakokinetische Charakterisierung von kovalenten Inhibitoren zur Adressierung von Krebs-relevanten Proteinkinasen
(2021) Hardick, Julia; Rauh, Daniel; Czodrowski, Paul
Die vorliegende Arbeit beinhaltet zwei Abschnitte: (i) die pharmakokinetische Charakterisierung von Inhibitoren mit dem Fokus auf der Analyse der metabolischen Stabilität in Anwesenheit von Lebermikrosomen, die einen Phase I Metabolismus nachbilden. Hierzu wurde ein entsprechendes Assaysystem in der Arbeitsgruppe etabliert. (ii) Das Struktur basierte Wirkstoffdesign, die organische Synthese von niedermolekularen Verbindungen und deren Charakterisierung, mit dem Ziel selektive und potente Inhibitoren für Krebs relevante Proteinkinasen zu identifizieren. Die Kombination aus biochemischem Aktivitätsassay und zellulärem Viabilitätsassay erlaubte eine Bewertung der generierten Substanzbibliotheken. Massenspektrometrische Studien ermöglichten die Analyse der kovalenten Adressierung des Zielproteins, sowie Komplexkristallstrukturen verwendet wurden, welche tiefere Einblicke in die Bindungsmodi der Inhibitoren erlaubten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Phase I Metabolismus Assays etabliert, der einen wichtigen Beitrag zur Optimierung und Weiterentwicklung der Inhibitoren leistet. Der Assay wurde in Gegenwart von humanen und murinen Lebermikrosomen durchgeführt, welche die Cytochrom P450 Enzyme beinhalten, durch die die Mehrheit der auf dem Markt zugelassenen Wirkstoffe abgebaut werden. Untersucht wurde die metabolische Stabilität von 200 Verbindungen über die Zeit, sodass Parameter wie die Halbwertszeit (t1/2) und die intrinsische Clearance (CLint) für eine Vielzahl an Verbindungen aus unterschiedlichen Projekten bestimmt und mit Referenzverbindungen verglichen werden konnten. Die Proteinkinase MKK7 ist Teil des JNK Signalwegs, dessen Fehlregulierung in neurodegenerativen Erkrankungen sowie bei Herzinfarkten mit darauffolgenden ischämischen Reperfusionsschäden identifiziert wurde. Unzureichende Selektivitätsprofile und mangelnde Wirksamkeit wurden bislang für JNK Inhibitoren beschrieben, weshalb die Adressierung der JNK aktivierenden Kinase MKK7 eine gute Alternative darstellt die genannten Selektivitätsmängel zu umgehen. Der literaturbeschriebene, potente Pyrazolopyrimidin-basierte kovalente MKK7 Inhibitor 24 sollte in komplexen zelluläre in vitro und ersten in vivo Modellsystemen getestet werden, weshalb zunächst ein Gramm der Verbindung hergestellt wurde. Die Identifizierung einer geeigneten Formulierung für die Substanz sowie die Bestimmung der maximal tolerierbaren Dosis bildeten die Grundlage für erste in vivo Mausstudien. Aus diesen ging bei 600 mg pro kg Körpergewicht der Maus durch IV Applikation eine maximale Plasmakonzentration von 5 µM hervor, sowie eine gute Verträglichkeit der Substanz. Die nur mäßige Löslichkeit der Verbindung stellte sich als problematisch dar, weshalb verschiedene Salzformen dargestellt wurden, von denen das HCl Salz 34 eine verbesserte Löslichkeit zeigte. Weiterhin wurde der Einfluss von 24 auf Reperfusionsschäden infolge eines Herzinfarktes in Mausmodellen untersucht. Hierbei wurden Herzinfarkte induziert und durch die präventive Vorab Gabe der entstandene ischämische Reperfusionsschaden im Vergleich zu unbehandelten Mäusen analysiert. Basierend auf den bislang erzielten Ergebnissen lässt sich ein geringerer ischämischer Reperfusionsschaden bei vorheriger Verabreichung von 24 vermuten. Die Behandlung von Krebs wurde in den letzten Jahren durch den Ansatz der Präzisionsmedizin revolutioniert. Hierbei können durch die Identifizierung von prädiktiven Biomarkern große Patientenpopulationen in Subgruppen unterteilt werden, die somit eine individuelle und maßgeschneiderte Therapie erhalten. Die zielgerichtete Adressierung mit TKIs wurde erfolgreich für die Proteinkinasen EGFR, KIT und PDGFR beschrieben. Her2, ein Mitglied der ErbB Rezeptorfamilie, wurde bei etwa 4 % aller Patienten mit NSCLC als Treiber identifiziert, wovon ca. 80 % Insertionsmutationen in Exon20 entsprechen. Geringe Überlebens und Ansprechraten von < 40 % auf die bislang angewendeten Therapien mit TKIs verdeutlichen den dringenden Bedarf an wirksamen Inhibitoren für Krebspatienten mit positivem Her2 Mutationsstatus. In dieser Arbeit wurden kovalente, Pyrrolopyrimidin basierte Typ II Inhibitoren mit dem Ziel weiterentwickelt, die Löslichkeit der Inhibitoren durch Einführung von Löslichkeitsgruppen zu steigern und somit eine verbesserte zelluläre Aktivität erzielen zu können. Durch Einbringung von polaren Alkohol und Amin-funktionalitäten in ortho Position zum Michael Akzeptor wurde eine gesteigerte biochemische, aber gleichbleibende zelluläre Aktivität festgestellt. Kristallisationsstudien verifizierten den angenommenen Bindungsmodus und die pharmakokinetische Charakterisierung zeigte bspw. Optimierungsbedarf bzgl. der Stabilität in murinem Blutplasma sowie in Lebermikrosomen. Mutationen in den Proteinkinasen KIT und PDGFR wurden bei der Mehrheit von Patienten mit gastrointestinalen Stromatumoren identifiziert. Die derzeitig zugelassenen Wirkstoffe für die Behandlung von GIST sind reversible, ATP kompetitive Inhibitoren, von denen lediglich Avapritinib und Ripretinib speziell für die Therapie von GIST entwickelt wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde basierend auf der Ponatinibstruktur eine Substanzbibliothek von Typ II bzw. Typ III Inhibitoren synthetisiert. Diese wurden mit einer reaktiven Gruppe dekoriert, um eine kovalente Bindung mit Cys788 oder Cys809 in KIT bzw. Cys814 oder Cys835 in PDGFR auszubilden. In MS und MS/MS Experimenten konnte die spezifische Bindung der synthetisierten Inhibitoren an Cys788 in KIT nicht nachgewiesen werden. Ferner wurden einzigartige, Patienten abgeleitete PDGFR mutierte Zelllinien entwickelt und in einem HTS eingesetzt. Die Durchmusterung von fokussierten Kinaseinhibitor-bibliotheken sollte zukünftig neue Leitstrukturen identifizieren, um spezifische Inhibitoren für PDGFR mutierte gastrointestinale Stromatumore designen und synthetisieren zu können.
Kristallisation und strukturbiologische Charakterisierung klinisch-relevanter Mutationsvarianten der Rezeptor-Tyrosinkinasen EGFR und Her2
(2021) Niggenaber, Janina; Rauh, Daniel; Watzl, Carsten
Lungenkrebs ist die häufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit.[1] In den letzten Jahren hat jedoch die sogenannte Präzisionsmedizin die Krebstherapie von Nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Patienten (NSCLC-Patienten) revolutioniert. Die Identifizierung von prädikativen Biomarkern sowie das detaillierte genetische Verständnis ermöglichte die Entwicklung niedermolekularer Verbindungen zur gezielten Inhibierung der aberranten Zielstrukturen genetisch definierter Patientengruppen. Durch die gezielte Adressierung der onkogenen Zielproteine können die Nebenwirkungen verringert werden, wodurch die Präzisionsmedizin eine vielversprechende Alternative zur platinbasierten Chemotherapie darstellt.[2,3] Genetische Mutationen, die zur Entstehung und zur Progression von NSCLC führen, sind häufig in den Rezeptor-Tyrosinkinasen zu finden. Hierbei sind im Rahmen dieser Arbeit vor allem der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) sowie der humane epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (Her2) zu nennen.[4,5] Die Entstehung von Resistenzmutationen innerhalb der Kinase-Domäne von EGFR, während der Behandlung mit zielgerichteten Tyrosinkinase-Inhibitoren, erfordert das stetige Aufklären der Resistenzmechanismen sowie die Entwicklung neuer Wirkstoffe.[6] Daher ist ein detailliertes Verständnis der Mutanten sowie der Protein-Inhibitor-Interaktionen auf molekularer Ebene für die Entwicklung neuartiger Verbindungen erforderlich. Die Proteinkristallographie stellt eine wichtige Methode zur Strukturaufklärung dar. [7,8] Allerdings sind bis zur finalen Kristallstruktur viele Herausforderungen wie das Konstruktdesign, die Proteinexpression in unterschiedlichen Expressionssystemen sowie die Proteinreinigung und die Identifizierung geeigneter Kristallisation-bedingungen zu meistern. Nach Optimierung der genannten Arbeitsschritte konnten im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Kristallisationssysteme Krebs-relevanter EGFR-Varianten etabliert werden, mit deren Hilfe ein verlässliches Wachstum qualitativ hochwertiger Proteinkristalle in Komplex mit niedermolekularen Verbindungen für die Strukturaufklärung ermöglicht werden konnte. Neben dem Interaktionsnetzwerk der Verbindungen und es Zielproteins konnten wichtige strukturelle Einblicke für weitere strukturbasierte Designansätze neuartiger Inhibitoren sowie Optimierungen bereits vorliegende Inhibitoren identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten insgesamt 47 finale Kristallstrukturen der EGFR-Mutationsvarianten generiert werden, von denen bisher zwölf in der Protein Data Bank publiziert wurden. [1] F. Bray, J. Ferlay, I. Soerjomataram, R. L. Siegel, L. A. Torre, A. Jemal. Global Cancer Statistics 2018: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. Ca: Cancer J. Clin. 2018, 68, 394-424. [2] A. Thomas, S. V. Liu, D. S. Subramaniam, G. Giaccone. Refining the Treatment of NSCLC According to Histological and Molecular Subtypes. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2015, 12, 511-526. [3] S. O. Dolly, D. C. Collins, R. Sundar, S. Popat, T. A. Yap. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung Cancer. Drugs 2017, 77, 813-827. [4] S. V. Sharma, D. W. Bell, J. Settleman, D. A. Haber. Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Lung Cancer. Nat. Rev. Cancer 2007, 7, 169-181. [5] J. Mendelsohn, J. Baselga. The EGF Receptor Family as Targets for Cancer Therapy. Oncogene 2000, 19, 6550-6565. [6] J. Lategahn, M. Keul, D. Rauh. Lessons To Be Learned: The Molecular Basis of Kinase-Targeted Therapies and Drug Resistance in Non-Small Cell Lung Cancer. Angew. Chem., Int. Ed. 2018, 57, 2307-2313. [7] M. W. Parker. Protein Structure from X-Ray Diffraction. J. Biol. Phys. 2003, 29, 341-362. [8] Z. Sayers, B. Avsar, E. Cholak, I. Karmous. Application of Advanced X-Ray Methods in Life Sciences. Biochim. Biophys. Acta. Gen. Subj. 2017, 1861, 3671-3685.
Strukturbiologische Untersuchung und zelluläre Charakterisierung kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren
(2020) Landel, Ina; Rauh, Daniel; Dehmelt, Leif
Aufgrund der Schlüsselposition der Proteinkinase Akt im PI3K/Akt-Signalweg resultiert aus genetischen Läsionen vorgeschalteter Proteine eine Überaktivierung der Kinase in verschiedenen Tumorerkrankungen. Zudem sind onkogene Mutationen der Akt-Kinase wie die E17K-Mutation bekannt, sodass die zielgerichtete Adressierung von Akt von großem Interesse in der medizinalchemischen Forschung ist. Dabei konnte das enorme Potential einer kovalent-allosterischen Modulation mit der Leitstruktur Borussertib durch dessen herausragende inhibitorische Potenz und Selektivität im Vergleich zu den in klinischen Studien untersuchten allosterischen und ATP-kompetitiven Akt-Inhibitoren bereits aufgelöst werden. Mit den in dieser Arbeit etablierten Zellsystemen konnten weiterführend die gesteigerte anti-proliferative Aktivität von Borussertib im Vergleich zu den Referenzinhibitoren gezeigt und die selektive Inhibition der Akt-Kinase und der nachgeschalteten Signalkaskaden durch Borussertib intrazellulär bestätigt werden. Außerdem konnte die in vivo-Wirksamkeit von Borussertib in Kombination mit dem MEK-Inhibitor Trametinib in KRas-mutierten Patienten-abgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX) nachgewiesen werden. Um eine ausreichende orale Bioverfügbarkeit zu erreichen, ist jedoch die weitere Optimierung von Borussertib im Rahmen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns (SBDD) erforderlich. Dafür konnte in dieser Arbeit ein verlässliches Kristallisationssystem für die Akt1-Kinase etabliert und somit 35 Kristallstrukturen im Komplex mit einer Vielzahl von kovalent-allosterischen Inhibitoren gelöst werden. Die erhaltenen Komplexstrukturen bestätigen die Bindung in der allosterischen Interdomänentasche sowie die kovalente Adressierung der in der Aktivierungsschleife befindlichen Cysteine. Zudem konnte mit dem vertieften Verständnis der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) die Grundlage für die weitere Optimierung der CAAIs geliefert werden. Um das SBDD auch zur Adressierung der onkogenen Akt1 E17K-Mutante zu ermöglichen, wurden zahlreiche Kristallisationsexperimente durchgeführt, welche letztendlich zur Identifizierung vielversprechender Bedingungen führten. Weiterhin konnten sowohl die biochemische als auch zelluläre Charakterisierung mit dem in dieser Arbeit generierten Ba/F3 Akt1 E17K-Zellsystem die Überlegenheit der CAAIs im Vergleich zu den klinischen Akt-Inhibitoren auch hinsichtlich der Adressierung der Akt1 E17K-Mutante auflösen. Die validierten Methoden zur Etablierung eines Kristallisationssystems konnten außerdem auf die Rezeptortyrosinkinasen c-Kit- und PDGFR, welche prominente Zielproteine in gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) darstellen, transferiert werden. Durch Reproduktion der beschriebenen Expressions-, Reinigungs- und Kristallisationsbedingungen konnten Kristalle des c-Kit Wildtyp-Proteins sowie vielversprechende Ansätze für PDGFR erhalten werden. Die Strukturanalyse der c-Kit-Kristalle lieferte dabei neue Ansätze zur Optimierung des Kristallisationskonstrukts.
Biochemische, kinetische und zelluläre Charakterisierung kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren
(2020) Weisner, Jörn; Rauh, Daniel; Summerer, Daniel
Die Proteinkinase B (auch: Akt) spielt eine essenzielle Rolle in einer Vielzahl zellulärer Signaltransduktionskaskaden, welche grundlegende Prozesse wie Proliferation, Überleben und Apoptose regulieren. Eine Fehlregulation von Akt ist mit diversen kardiovaskulären, neurodegenerativen sowie onkologischen Krankheitsbildern assoziiert. Häufig sind genetische Läsionen in den vorgeschalteten Proteinen wie PI3K und PTEN ursächlich für derartige Erkrankungen, aber auch Alterationen in membranständigen Rezeptor-Tyrosinkinasen wie EGFR und c-Kit können pathologische Änderungen in der Akt-vermittelten Signalweiterleitung bewirken. Direkte Läsionen in Akt, wie bspw. die aktivierende somatische Mutation E17K oder eine Amplifikation und Überexpression von Akt, treten weniger häufig auf, können jedoch ebenfalls als treibender Bestandteil in der Pathogenese involviert sein. Eine pharmakologische Inhibition von Akt kommt daher als vielseitige Strategie für die therapeutische Behandlung diverser Erkrankungen in Frage. Neben den klassischen ATP-kompetitiven Inhibitoren, welche zumeist unzureichende Selektivitätsprofile aufweisen und signifikante Nebenwirkungen induzieren, existieren für Akt auch allosterische Liganden, welche an der Grenzfläche zwischen regulatorischer PH-Domäne und katalytischer Kinase-Domäne binden. Dieser einzigartige Bindungsmodus gewährt eine ausgezeichnete Selektivität für das Zielprotein verbunden mit einer Minimierung der möglichen off-target-vermittelten Toxizitäten. In der vorliegenden Arbeit wird das rationale Design sowie die Charakterisierung von kovalent-allosterischen Akt-Inhibitoren in biochemischen und zellulären Systemen beschrieben. Basierend auf Komplexkristallstrukturen mit reversibel bindenden Liganden wurden in computergestützten Modellierungsansätzen initial neue Moleküle, welche zusätzlich mit einem Cystein-reaktiven Michael-Akzeptor dekoriert sind, entworfen. Mithilfe von massenspektrometrischen und Aktivitäts-basierten Analysen konnte für eine fokussierte Substanzbibliothek auf Basis des 1,6-Naphthyridinon-Grundgerüsts ein kovalenter Bindungsmechanismus sowie eine potente Inhibition von Akt1 in vitro nachgewiesen werden. In weiterführenden strukturbiologischen Untersuchungen konnten für vier der dargestellten Verbindungen Komplexkristallstrukturen mit Akt1 gelöst und hierdurch die Besetzung der allosterischen Bindetasche in Akt1 sowie die irreversible Bindung zu Cys296 bzw. Cys310 nachgewiesen werden. Unter Verwendung von zellulären, Krebs-relevanten Modellsystemen konnte die anti-proliferative Wirksamkeit dieser neuartigen Substanzklasse abgebildet werden, welche anhand von Western Blot-Studien auf die on-target-Inhibition von Akt zurückgeführt werden konnte. In Folge von in vitro pharmakokinetischen Untersuchungen konnte mit Verbindung 3a (Borussertib) eine Leitstruktur identifiziert werden, deren vielversprechenden Aktivitäts-, Selektivitäts- und PK-Profile eine anschließende Evaluierung in in vivo-Modellen erlaubten. Trotz einer unzureichenden oralen Bioverfügbarkeit sowie einer moderaten MTD von 20 mg/kg bei intraperitonealer Applikation konnte die in vivo-Wirksamkeit der Leitstruktur in Patient-abgeleiteten Xenograft-Modellen des Kolorektal- sowie Pankreaskarzinoms in Kombination mit dem MEK-Inhibitor Trametinib gezeigt werden. Diese Eigenschaften verdeutlichen das Potential der kovalent-allosterischen Akt-Inhibition und bilden zeitgleich das Rational für die Weiterentwicklung und Optimierung der Leitstruktur zum klinischen Kandidaten. Ein weiteres Projekt beinhaltete die Identifikation und Charakterisierung von Modulatoren des Keap1/Nrf2-Signalwegs, welcher zytoprotektive Funktionen gegenüber oxidativem Stress und Entzündungsprozessen, die in der Entstehung von kardiovaskulären und neurodegenerativen Krankheitsbildern beteiligt sind, vermittelt. Zusätzlich kann eine Fehlregulation von Nrf2 für die Tumorentstehung und progression förderlich sein. Unter Verwendung eines Fluorophor-markierten, Nrf2-mimikrierenden Sondenpeptids und der rekombinanten Kelch-Domäne von Keap1, welche die Protein-Protein-Interaktion mit Nrf2 vermittelt, wurde ein Hochdurchsatz-kompatibler, Fluoreszenzpolarisations-basierter Assay entwickelt. Mithilfe dieses Assays und der Screening-Plattform RASPELD wurde die ca. 30000 Substanzen-umfassende in-house Bibliothek nach Modulatoren der Keap1/Nrf2-PPI durchmustert. Zwar konnte keins der identifizierten Hit-Moleküle in Folgestudien als Inhibitor validiert werden, der entwickelte Assay erweitert dennoch das Portfolio der Screening-Plattform RASPELD und fungiert dabei als Grundlage für zukünftige Screening-Kampagnen auch hinsichtlich der Identifikation von möglichen Stabilisatoren der Keap1/Nrf2-Interaktion. Desweiteren wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Elektronenspinresonanz-Spektroskopie-basierte Studien an der p38α MAPK hinsichtlich der konformationellen Plastizität und Aktivierungsschleifendynamik durchgeführt. Hierfür wurde ein heterolog exprimiertes und positionsspezifisch mit dem spin label MTSSL markiertes p38α-Konstrukt eingesetzt und in An- und Abwesenheit von Typ I- und Typ II-Inhibitoren charakterisiert. Die rotatorische Mobilität des eingebrachten Spinmarkers ermöglichte hierbei die Quantifizierung von konformationellen Zuständen in p38α in Abhängigkeit der Ligandenbindung. Mithilfe dieser Methodik konnten zwei separate Zustände der Aktivierungsschleife identifiziert werden, welche der DFG-in- bzw. der DFG-out-Konformation zugeordnet werden konnten und im apo-Zustand im Verhältnis 9:1 vorlagen. Anders als in vorhandenen Komplexkristallstrukturen konnte für keinen der getesteten Typ I- bzw. Typ II-Inhibitoren eine vollständige Verschiebung des Konformations-gleichgewichts zugunsten eines einzelnen Zustands beobachtet werden. Stattdessen waren unabhängig vom gebundenen Liganden beide Konformationen koexistent. Temperaturabhängige Messungen erlaubten die Evaluierung des Konformationsübergangs von DFG-in nach DFG-out auf thermodynamischer Ebene. Im apo-Zustand sowie in der Typ I-Inhibitor-gebundenen Form von p38α war die Gibbs-Energie ΔG positiv, d. h. der Konformationsübergang ist energetisch ungünstig. Für die Typ II-stabilisierte Konformation wurden im Vergleich geringere Reaktionsenthalpien und -entropien ermittelt, was wiederum für eine bevorzugte Adaption der DFG-out-Konformation spricht. Neben der thermodynamischen Differenzierung zwischen Typ I- und Typ II-Inhibitoren bilden die hier präsentierten Ergebnisse auch die Grundlage für detaillierte Folgestudien wie bspw. Abstands-basierte Multilaterationsansätze. Diese ermöglichen eine dreidimensionale Kartierung von flexiblen und dynamischen Strukturelementen in Proteinen, wie bspw. der Aktivierungsschleife in Proteinkinasen, die in Kristallstrukturen häufig unzureichend aufgelöst sind.
Etablierung von biochemischen und strukturbasierten Systemen zur Charakterisierung wirkstoffresistenter EGFR-Mutanten
(2019) Keul, Marina; Rauh, Daniel; Dehmelt, Leif
Die Identifikation von EGFR-Mutationen in Exon19 und Exon21 als prädiktive Biomarker, die mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber EGFR-Inhibitoren der ersten Generation assoziiert werden konnten, leitete einen Paradigmenwechsel in der Behandlung von NSCLC-Patienten ein.[1-2] In entsprechenden Studien konnte retrospektiv gezeigt werden, dass lediglich Tumore auf die Behandlung mit Gefitinib ansprachen, wenn eine somatische EGFR-Mutation vorlag und im Umkehrschluss Patienten ohne die entsprechende Mutation nicht von der Behandlung mit Gefitinib profitierten, obwohl die Tumore von einer Entität des gleichen Gewebetyps abgeleitet wurden.[3-4] Anhand dieses Beispiels wurde einerseits das enorme Potential der zielgerichteten Therapie deutlich, aber auch die Tatsache, dass ein tiefgründiges Verständnis der Tumorbiologie eine Voraussetzung für die erfolgreiche zielgerichtete Krebstherapie darstellt. Mit dem Ziel charakteristische Merkmale der einzelnen EGFR-Mutanten herauszuarbeiten und innerhalb von Optimierungsstudien an neuartigen Inhibitoren SAR-Profile erstellen zu können, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene biochemische und strukturbiologische Systeme für Untersuchungen an wirkstoffresistenten Varianten des EGF-Rezeptors etabliert. Dazu wurde im ersten Schritt die Proteinexpression für einzelne Mutanten des EGFRs in Insektenzellen etabliert und optimiert, um im Anschluss diese durch geeignete Reinigungsstrategien in ausreichender Menge und Reinheit zu erhalten. Auf diesem Weg wurden die EGFR-del19, EGFR-del19/G724S und die EGFR-L858R/T790M/C797S Mutanten für biochemische Assays und die EGFR-T790M/E865A/E866A/K867A sowie die EGFR-T790M/V948R Variante für Kristallisationsstudien erhalten. Ferner konnten entsprechende aktivitätsbasierte Assaysysteme etabliert und Kristallisationssysteme für die EGFR-T790M/V948R Mutante entwickelt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Charakterisierung von neuartigen Inhibitoren zur Adressierung der EGFR-T790M Mutante, wobei die kovalente Adressierung des Cys797 in vorangegangenen Studien als entscheidender Faktor für die effiziente Inhibition der Türstehermutante identifiziert und durch die Einführung von Michael-Akzeptorsystemen in verschiedene Gerüstklassen realisiert wurde. Aufgrund des kovalenten Charakters der Bindungsmechanismus ist eine Beurteilung der Aktivität in biochemischen Systemen anhand des IC50-Werts nur schätzungsweise möglich. Daher wurden detaillierte kinetische Bindungsstudien zur Bestimmung der initialen reversiblen Affinität Ki einer Verbindung zum Enzym und der Rate der Inaktivierung kinact herangezogen und distinkte Profile der einzelnen Gerüstklassen ermittelt. So zeigte sich für Pyrazolopyrimidin-basierte Inhibitoren und Pyrimidin-abgeleitete Inhibitoren eine hohe Abhängigkeit der inhibitorischen Wirksamkeit vom kovalenten Charakter der Bindung, was sich in hohen kinact-Werten manifestierte. In Korrelation mit diesen Daten, resultierte die Einführung der C797S-Mutation in einem drastischen Verlust der inhibitorischen Aktivität. Weiterhin wurden Pyrrolopyrimidin-basierte Inhibitoren kinetisch evaluiert, für die eine ausgesprochen hohe reversible Affinität nachgewiesen werden konnte und Ki-Werte der Verbindungen im subnanomolaren Bereich gegenüber der EGFR-L858R/T790M Mutante ermittelt wurden. An dieser Stelle konnte zum ersten Mal eine hohe inhibitorische Potenz gegenüber der EGFR-L858R/T790M/C797S Mutante in biochemischen Assays beobachtet werden, so wurde beispielsweise für den Inhibitor RL2029 ein IC50-Wert von etwa 8 nM festgestellt. Im Folgenden konnte diese Aktivität aber nicht in zelluläre Potenz translatiert werden, welches auf die schlechte Zell-Permeabilität der Verbindungen zurückzuführen sein könnte und einen Ansatzpunkt für weitere Optimierungsstudien darstellt. In dieser Arbeit wurde außerdem eine Durchmusterung der laborinternen Substanzbibliothek nach aktiven Verbindungen gegenüber der PC9-T790M/C797S Zelllinie mit Hilfe der semi-automatisierten Screening-Einheit RASPELD vorgenommen. Hierbei wurden initial 148 Verbindungen identifiziert, die eine Reduktion der Viabilität der untersuchten Zellen um 70% hervorriefen. In weiterführenden Hitvalidierungsstudien wurden fünf interessante Substanzen identifiziert, die EC50-Werte im niedrigen mikromolaren Bereich gegenüber EGFR-mutierten Zelllinien zeigten und gleichzeitig keine Aktivität gegenüber EGFR-WT Zelllinien demonstrierten. Jedoch konnte in biochemischen aktivitätsbasierten Assaysystemen keine inhibitorische Aktivität der Hitverbindungen gegenüber den verschiedenen EGFR-Varianten festgestellt werden, sodass Western-Blot Studien angeschlossen werden sollten oder gegebenenfalls andere Zielstrukturen der Verbindungen in Betracht gezogen werden sollten. In einem weiteren Teil dieser Arbeit erfolgte innerhalb eines Kooperationsprojektes eine tiefgreifende Charakterisierung der kürzlich identifizierten EGFR-del19/G724S Mutation, die in Patienten eine Wirkstoffresistenz gegenüber des Drittgenerationsinhibitors Osimertinib vermittelt. In biochemischen Assays konnte die klinische Beobachtung verifiziert und nachgestellt werden, sodass das etablierte System als Grundlage für Screening-Experimente genutzt werden konnte. Die Durchmusterung einer fokussierten Substanzbibliothek ergab signifikante Unterschiede in der Potenz der einzelnen Generationen an EGFR-Inhibitoren, sodass abgeleitet werden konnte, dass die del19/G724S-Mutation eine Resistenz gegenüber allen bekannten Drittgenerationsinhibitoren vermittelt. Weiterhin konnten Zweitgenerationsinhibitoren wie Afatinib und Poziotinib als potente Inhibitoren identifiziert werden, für die auch in kinetischen Profilierungen eine hohe Affinität (Ki<1 nM) gegenüber der Osimertinib-resistenten Mutation nachgewiesen werden konnte. Schlussendlich konnte die hohe inhibitorische Wirksamkeit des Afatinibs gegenüber der EGFR-del19/G724S Mutante in zelluläre Potenz und in vivo Aktivität gezeigt werden.
Covalent-allosteric inhibitors to achieve akt isoform-selectivity
(2019-10-04) Quambusch, Lena; Landel, Ina; Depta, Laura; Weisner, Jörn; Uhlenbrock, Niklas; Müller, Matthias P.; Glanemann, Franziska; Althoff, Kristina; Siveke, Jens T.; Rauh, Daniel
Isoforms of protein kinase Akt are involved in essential processes including cell proliferation, survival, and metabolism. However, their individual roles in health and disease have not been thoroughly evaluated. Thus, there is an urgent need for perturbation studies, preferably mediated by highly selective bioactive small molecules. Herein, we present a structure‐guided approach for the design of structurally diverse and pharmacologically beneficial covalent‐allosteric modifiers, which enabled an investigation of the isoform‐specific preferences and the important residues within the allosteric site of the different isoforms. The biochemical, cellular, and structural evaluations revealed interactions responsible for the selective binding profiles. The isoform‐selective covalent‐allosteric Akt inhibitors that emerged from this approach showed a conclusive structure–activity relationship and broke ground in the development of selective probes to delineate the isoform‐specific functions of Akt kinases.

Browse

Recent Submissions