Lehrstuhl für Zellbiologie

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http://hdl.handle.net/2003/25889

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The small GTPase RAB18: Insights into cellular steatosis, lipophagy and the non-alcoholic fatty liver disease
(2021) Rieck, Adrian; Hengstler, Jan; Bastiaens, Philippe
Non-alcoholic fatty liver disease is a rapidly growing concern for public health. Its most prevalent marker is steatosis, which is the accumulation of large lipid storage organelles called lipid droplets (LD) in the hepatocytes. RAB18, a member of the Rab family, localizes to the LD membrane. Rab family proteins are regulators of cellular membrane trafficking, therefore RAB18 is expected to play a role regulating LD biology. The presented work aims to elucidate this role as well as the mechanisms behind the localization of RAB18 to the LD membrane. The localization of RAB18 was investigated by overexpressing mutant RAB18 variants in HepG2 cells. RAB18 localization was observed to depend on the reversible cyclical palmitoylation of its C-terminus. Using FRAP experiments, it could be shown that targeting the palmitoylation machinery with small molecule inhibitors modulated RAB18 localization. This coincided with changes in LD size in cells treated with de-palmitoylation inhibitors. An overall increase in LD size was observed in HepG2 cells with RAB18 downregulation. The wild type LD size in these cells was restored by the inhibition of autophagy. This size reduction was due to newly created LDs. Inhibition of autophagy prior to LD accumulation was subsequently tested in vitro on primary human hepatocytes in sandwich culture. Inhibition of autophagy by chloroquine resulted in a dose dependent rise in LD number and a decrease in average LD size in these cells. These effects could be translated to the in vivo situation in mice. Daily chloroquine injection of mice on a steatogenic diet resulted in a significant decrease of LD size in vivo. Conversely, no changes were detected in the blood-values of treated mice compared with the control. This thesis demonstrates, that RAB18 localizes to the LD via a C-terminal acylation cycle. RAB18 reduces the size of LDs by modulating autophagy of newly formed LDs. This mechanism is important for LD number and size regulation in hepatocytes.
PDEδ interference impedes the proliferation and survival of oncogenic KRas expressing human cancer cell lines
(2018) Klein, Christian H.; Bastiaens, Philippe; Dehmelt, Leif
Ras proteins, most notably isoform KRas4B are frequently mutated oncogenes in numerous human cancers and associated with poor prognosis. Despite ambitious research affords since the discovery of Ras proteins as human oncogenes in 1982, no pharmacological therapy approach reached the clinic yet and Ras is still viewed as “undruggable” protein. For signal propagation, Ras proteins have to be localized at the plasma membrane. Enrichment there is facilitated by spatial cycles that utilize the prenyl binding protein PDEδ as solubilizing factor. Thus, instead of targeting Ras proteins directly, interference with its spatial organization by targeting PDEδ was studied as promising alternative. First generations of small molecule inhibitors of PDEδ were reported to selectively affect proliferation of oncogenic KRas-dependent human pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines. Here, we characterize the activity of a new small molecule inhibitor chemotype called Deltasonamide in cells. We show that Deltasonamide administration leads to a depletion of KRas from the plasma membrane and report enhanced anti-proliferative effects of the high affinity inhibitor in oncogenic KRas-dependent human pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines, for the first time at sub-micromolar concentrations. Furthermore, we demonstrate that PDEδ inhibition is also an applicable tool to interfere with aberrant KRas signaling in human colorectal cancer cell lines. Both PDEδ knock down and small molecule inhibition selectively reduced proliferation and viability of colorectal cancer cell lines harboring oncogenic KRas mutations, whereas cell lines expressing only wild type KRas were not affected by interference with PDEδ. Moreover, we report an interdependence of oncogenic KRas activity and PDEδ’s solubilizing function that is manifested in the correlation of both proteins within the cell lines and well reflected in the distinct survivability after PDEδ interference. Together, our results show that PDEδ is a valid therapeutic target in both pancreatic ductal adenocarcinoma and colorectal cancer harboring oncogenic KRas mutations.
Vesicular trafficking dynamics enable context-dependent regulation of ErbB receptor activity and signaling
(2018) Brüggemann, Yannick; Bastiaens, Philippe; Musacchio, Andrea
The ErbB signaling network comprises a complex dynamic system, which regulates a diverse set of cellular behaviors. In this thesis, we examined how regulating the distribution of ErbB receptors between the plasma membrane and different endosomal compartments enables contextual regulation of receptor activity and signaling. In the first part of this work, we investigated how spatial regulation of EGFR controls its autocatalytic activity. We found that autonomously activated and EGF activated receptors are processed differently by the endocytic machinery. Constitutive vesicular recycling through perinuclear areas with high PTP1B phosphatase activity suppresses autonomous receptor activation in the absence of ligand, while maintaining EGFR abundance at the PM. In contrast, EGF binding enhances EGFR self-association and phosphorylation of the c-Cbl docking tyrosine Y1045, which results in receptor ubiquitination, internalization and lysosomal degradation. The coupling of EGFR self-association state, ubiquitination and vesicular dynamics thereby allows for the coexistence of a continuous safeguard cycle, while maintaining sensitivity to growth factor stimulation.In the second part of this work, we examined how ligand-specific ErbB receptor trafficking determines Erk signaling dynamics and localization. We found that EGF or heregulin (HRG) differentially modulate ErbB receptor trafficking to generate distinct spatiotemporal patterns of receptor activities, leading to the activation of Erk from different subcellular compartments (plasma membrane and endosomes). The subcellular localization of Erk activation influences its interaction with different effector proteins and thereby generates ligand-specific cellular responses. Proliferative Erk signals are transmitted to the nucleus, irrespective of their spatial origin, while the Erk dependent phosphorylation of pro-migratory effectors relies on membrane proximal Erk activity. Collectively our findings highlight how vesicular dynamics enable context dependent spatial regulation of ErbB activity and downstream signaling events.
MAPK related phenotypic decisions in yeast
(2015-03-26) Jarzombek, Johann; Bastiaens, Philippe I.; Musacchio, Andrea
The evolutionarily conserved mitogen-activated protein kinase (MAPK) network is a signalling module, which enables the coordination and processing of various extracellular stimuli. It thereby guarantees a specific biological response to a precise dose of a given stimuli. The haploid yeast Saccharomyces cerevisiae uses this network to select particular mating partners by quantitatively interpreting the pheromone concentration gradient generated by potential mates. Activation of the mating MAPK module occurs only above a certain pheromone concentration threshold and relies on the pheromone-induced recruitment of a protein complex consisting of the scaffold Ste5 and the MAPKs Ste11, Ste7 and Fus3. This module ensures a robust morphological response in form of a mating projection to a defined pheromone concentration and allows cells to gauge the distance to a potential mating partner. Yet it remains unclear which of the module’s features interpret the pheromone concentration to decide when and where to generate a mating projection. To infer the network structure of the mating MAPK module, we developed a reverse engineering approach, which is based on the detection of pheromone response dependent changes in protein complex abundances. Interactions within the MAPK module were measured by fluorescence correlation spectroscopy (FCS), of which all possible protein-species in the MAPK module were resolved by applying a linear regression analysis (LRA). Using this approach, we were able to identify a cytosolic kinase-substrate interaction between Fus3 and the upstream Ste11, which constitutes a hitherto uncharacterized negative feedback. It affects the readout of the pheromone gradient and provides robustness to changes in the components involved in the loop. This negative feedback occurs by phosphorylation of S243 on Ste11 that hinders its binding to the scaffold Ste5 and thereby uncouples Ste11 from Fus3 activity. Controlling this mechanism provides ultrasensitivity at the first step of the MAPK cascade, as part of the hierarchical cascade arrangement, ensures a switch-like mating response and triggers shmoo formation at the right distance to a partner. This cytoplasmic feedback has a spatial component that confines the cytoplasmic Fus3 phosphorylation gradient. It thereby generates and maintains a localized source of active Fus3 at the mating tip, which in turn spatially restricts shmoo formation. This work shows how a network motif in the MAPK module enables the interpretation of the pheromone concentration gradient to sense potential mates, and how this extracellular gradient is translated into an intracellular activity gradient by spatial control of signalling, ultimately deciding both when and where to respond.
Interference with the spatial organization of Ras in cancer cells
(2015) Truxius, Dina Carolin; Bastiaens, Philippe; Wehner, Frank
Oncogenic KRas is associated with a multitude of human cancers, like pancreatic, colorectal, and lung carcinomas, concomitant with poor prognosis and survival. Oncogenic mutations retain Ras in a constitutively active conformation, causing sustained activation of downstream signaling cascades, which leads to uncontrolled proliferation and survival. Hence, all Ras proteins are interesting molecules for targeted cancer therapies. Although the structure and functions of Ras proteins are known, it still remains an “undruggable” protein so far. In this work, the cancer phenotype upon RNAi and pharmacological inhibition in several KRas addiction model systems was elaborated. First, in a panel of hu-man cancer cell lines, from various tumor origins, the interference with the cancer phenotype after PDEδ inhibitor treatment and inducible shRNA-mediated downmodulation of PDEδ was studied. These cell lines exhibited different degrees of oncogenic KRas dependencies and a strong effect on cell survival could only be observed in KRas-dependent pancreatic and lung tumor cells, whereas colorectal carcinoma cells with an oncogenic KRas background were only slightly affected. Cells with wildtype KRas remained mostly unaffected. The new class PDEδ inhibitor Deltazinone 1 and the genetic manipulation of PDEδ showed identical effects on cell growth, demonstrating that PDEδ is a valid tar-get for the pharmacological therapy of KRas-dependent tumors. Second, murine pancreatic cancer cells, derived from transgenic mice, with ei-ther one (oncogene addiction) or two oncogenic mutations (synthetic sickness) were used for a synthetic lethal screen in the presence of small molecule PDEδ inhibitors. Both cell lines either express oncogenic KRas or oncogenic KRas in combination with mutant p53 under the control of endogenous promoters. Here, the cell line with the additional loss of p53 fuction seemed to be more resistant to PDEδ inhibition by Deltarasin. This work demonstrates that the availability of PDEδ is inevitable to ensure survival of oncogenic KRas-dependent cancer cells. The effects on growth in hu-man KRas-dependent cell lines and the different behaviors observed in the mu-rine systems prove that the mutation status is critical for the susceptibility to-wards PDEδ inhibition and the resulting interference with the spatial organiza-tion of KRas. The acquisition of additional oncogenic mutations allows for better adaptation to changes in the environment and ensures cellular survival.
Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of human embryonic stem cells into hepatocyte like cells
(2015) Natarajan, Karthick; Hengstler, Jan Georg; Sachinidis, Agapios
Das Potenzial von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs), in Hepatozyten-ähnliche Zellen (hepatocyte like cells, HLCs) zu differenzieren, ermöglicht Hepatozyten in unbegrenzter Anzahl für pharmakologische und toxikologische Untersuchungen sowie für Zelltherapien zur Behandlung von Leberversagen herzustellen. Obwohl zahlreiche wissenschaftliche Untersuchungen über die erfolgreiche Herstellung von HLCs aus hESCs berichten, existieren immer noch kontroverse Angaben über die Ausprägung des Differenzierungsgrades zu homogenen Populationen von reifen Hepatozyten. Das primäre Ziel dieser Promotionsarbeit war es, ein umfassenderes Verständnis der Eigenschaften von stammzellabgeleiteten HLCs zu erreichen. Hierfür wurden durch die Verwendung eines bewährten Protokolls hESCs zu HLCs differenziert. Die Charakterisierung und Identität der stammzellabgeleiteten HLCs erfolgte durch die Ermittlung der Genexpressionsignatur mittels GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays. Die HLCs Genexpressionsignatur wurde anschließend mit der Genexpressionsignatur von hESCs und von frisch isolierten adulten Hepatozyten sowie von bis zu 14 Tage lang kultivierten adulten Hepatozyten verglichen. Durch die Anwendung eines breiten Spektrums von bioinformatischen Analyseprogrammen konnten die Gennetzwerke für erfolgreiche und erfolglose Hepatozytendifferenzierung sowie die involvierten regulativen Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. Die Analyse der regulatorischen Gennetzwerke zeigte, dass HLCs einen hybriden Zelltyp darstellen, welcher Gensignaturen von Leber-, Darm-, Bindegewebs- und Stammzellen zeigt. Der unerwünschte “Colon”-Phänotyp stand hierbei im Zusammenhang mit XIV Transkriptionsfaktoren wie KLF5 und NKX2-3 sowie dem CDX2-Transkriptionsnetzwerk. Durch Clusteranalysen konnten stark korrelierende Gengruppen identifiziert werden, welche sowohl mit Funktionen der reifen Leber und einer Herunterregulierung der Zellproliferation zusammenhängen, als auch dem Expressionslevel der adulten Hepatozyten nahe kamen. Allerdings erreichten drei weiteren Gencluster nicht das Expressionslevel adulter Hepatozyten. Zwei dieser Cluster beinhalteten die Schlüsseltranskriptionsfaktoren SOX11, FOXQ1 und YBX3. Die dritte nicht erfolgreich exprimierte Clustergruppe, welche u.a. durch die Transkriptionsfaktoren HNF1A, CAR, FXR und PXR kontrolliert wird, zeigte signifikante Überschneidungen mit Genen, die in kultivierten Hepatozyten eher unterdrückt waren als in frisch isolierten Hepatozyten. Dies deutet darauf hin, dass in den gegenwärtig verwendeten invitro Kulturbedingungen essentielle Stimuli für den Erhalt der Genexpression von Hepatozyten fehlen. Demzufolge könnten hierdurch auch die vergleichbaren Defizite von HLCs erklärt werden. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass durch den in dieser Arbeit verwendeten Ansatz zur Untersuchung von Genregulationsnetzwerken wichtige Transkriptionsfaktoren identifiziert werden konnten, welche sich als Interventionsziele zur Verbesserung der Differenzierung von hESCs zur reiferen HLCs anbieten.
Development of a β-catenin stability sensor
(2015) Prost, Katrin; Bastiaens, Philippe I.; Hengstler, Jan G.
The cytosolic state of the integrin adhesome and its relation with cell matrix adhesion sites
(2014-07-18) Hoffmann, Jan-Erik; Zamir, Eli; Bastiaens, Philippe I.; Wehner, Frank
Spatially resolving the dynamics and structure of protein networks in adhesion sites
(2014-07-09) Malik Sheriff, Rahuman S.; Zamir, Eli; Bastiaens, Philippe I.; Ickstadt, Katja
Single molecule imaging of the signaling activity of the epidermal growth factor receptor
(2014-02-25) Ibach, Jenny; Bastiaens, Philippe I.; Goody, Roger S.
Der EGF-Rezeptor (engl. epidermal growth factor), auch ErbB1 genannt, gehört zu den Rezeptor-Tyrosinkinasen und ist an verschiedenen zellulären Prozessen, wie der Proliferation und der Differenzierung, beteiligt ist. Die extrazellulären Domänen des Rezeptors können verschiedene Liganden binden, unter anderem EGF. Teile dieser extrazellulären Domänen, sowie die Transmembrandomäne und die Juxtamembran-Domäne spielen eine Rolle bei der Dimerisierung des Rezeptors. Nach Bindung eines Liganden bildet die intrazelluläre Kinasedomäne ein asymmetrisches Dimer mit der Kinase eines zweiten Rezeptors, wodurch die Autophosphorylierung verschiedener Serine und Tyrosine am C-terminalen Ende des Rezeptors stattfindet. Dort binden Effektorproteine, welche das Signal in die Zelle weiterleiten. In dieser Arbeit konnte der kurzlebige Charakter der Rezeptor-Dimerisierung und der Cluster- Bildung durch die Verfolgung fluoreszenzmarkierter Rezeptoren in lebenden Zellen auf Einzelmolekül-Ebene visualisiert werden. Gleichzeitig wurde die Aktivität des Rezeptors durch eine Sonde für den Phosphorylierungszustand verfolgt. Auch nach Aktivierung wechselt ErbB1 permanent zwischen mehreren kurzlebigen Mobilitätszuständen, deren Diffusionskoeffizienten einen Bereich von zwei Größenordnungen umfassen. Dies verdeutlicht, dass die Aktivierung von ErbB1 ein hochdynamischer Prozess ist. In unstimulierten Zellen liegt der Rezeptor hauptsächlich monomer vor, was gegen eine entscheidende Rolle der Vordimerisierung bei der Aktivierung von ErbB1 spricht. Nach Stimulierung mit EGF assoziieren die Rezeptoren und lokalisieren in hochaktiven, immobilen Clustern, welche mit Clathrinumhüllten Einstülpungen kolokalisieren. Demnach wird das Signal durch die Rekrutierung der Rezeptoren zu Clathrin-umhüllten Einstülpungen vor der Endozytose an der Membran stabilisiert und amplifiziert. Allerdings sind die Rezeptoren dort nicht unbedingt gefangen, da sie immer noch zwischen den Mobilitätszuständen wechseln können. Experimente mit einem Kinaseinhibitor und einer Kinase-inaktiven Mutante des Rezeptors zeigten, dass diese zwar den immobilen Zustand erreichen, aber dass für die Cluster-Bildung auch die Kinaseaktivität benötigt wird. Zudem zeigten Experimente mit einem Phosphataseinhibitor, dass die Bindung eines Liganden für die Cluster-Bildung aktiver ErbB1 Rezeptoren nicht notwendig ist. In Zellen mit geringem Expressionslevel von ErbB1, ist die meiste Aktivität des Rezeptors räumlich beschränkt in Clathrin-umhüllten Einstülpungen zu finden, wohingegen eine gleichmäßige Verteilung der Aktivität bei Überexpression beobachtet wird. Die Anhäufung in hochaktiven Membranbereichen beschreibt einen möglichen Mechanismus, um bei geringem Expressions-level des Rezeptors eine stabile Signalweiterleitung zu gewährleisten.
Genome-wide response patterns in stressed hepatocytes
(2014-02-12) Campos Melo, Gisela Lorena; Hengstler, Jan; Wehner, Frank
The spatial organization of EPH receptor tyrosine kinase activity
(2013-11-19) Sabet, Ola; Bastiaens, Philippe; Winter, Roland
Eph receptors (Ephs) and their membrane bound ephrin ligands constitute one of the major guidance cues that control developmental and pathological cell positioning. As in other receptor tyrosine kinases (RTKs), ligand binding induces oligomerization of Ephs at the plasma membrane (PM), activation of their intrinsic autocatalytic activity and phosphorylation of key tyrosine residues in their intracellular domain. In this thesis, we asked how the autocatalytic activity of Eph is dynamically controlled inside cells to prevent spurious self-activation yet allow for robust activation upon exposure to ligand. The current view in Eph signaling is that ligand-driven oligomerization of Ephs converts inactive monomers to active oligomers. However, in this thesis we show that the mechanism of receptor clustering is not that simple. Using an FKBPbased dimerizing system, we investigated the effect of cluster size composition on EphB2 cellular output. We found that small-sized EphB2 clusters produce a functional response, whose strength is determined by the abundance of multimers over dimers within a cluster population. In addition, we identified a positive regulatory effect on EphB2 clustering by GRIP1 protein and a negative regulatory effect on ephrin-induced clustering by C-terminal domains of EphB2. Together these results showed how the cell’s pre-established molecular context could determine the response of Ephs to ephrins, which is then translated into clusters with different size, composition and/or stability. The autocatalytic activity of Eph receptors is regulated by reversible autophosphorylation and dephosphorylation cycles that are spatially and temporally partitioned within cells due to the interactions with protein tyrosine phosphatases (PTPs). Using quantitative cellular imaging approaches, we found that the endoplasmic reticulum (ER)-anchored PTP1B comes in close proximity to regions of cell-cell contact rich in Eph receptors and identified EphA2 as a new substrate for PTP1B specifically at those regions. These results highlighted ER-PM interactions as an emerging new paradigm in cellular signaling. To investigate how Eph conformational dynamics as well as its spatial organization within cells can affect its inherent autocatalytic activity, we designed a genetically encoded biosensor that monitors EphA2 conformation, termed Linker optimized Intramolecular-FRET based sensor for EphA2 (LIFEA2). By measurements of LIFEA2 conformational dynamics, we could describe EphA2 activation with precise spatial temporal resolution. In addition, by correlating the cell-to-cell variance in LIFEA2 expression level to its activity state, we demonstrated the propensity of this autocatalytic system to self-activate in the absence of ligand. Finally, we described two levels of regulation for EphA2 activation, a cis-inhibitory dynamic interaction between the kinase domain and the juxtamembrane segment, and a novel PM-recycling mediated mechanism. The continuous recycling of EphA2 to the PM acts as a safeguard mechanism by maintaining a low steady-state level of receptor at the PM and by trafficking the receptor through peri-nuclear areas with high PTP1B activity that dephosphorylates spuriously autoactivated receptors.
Regulation of autophagy in mammalian cells by stress activated signaling pathways
(2013-04-02) Amin, Jakia; Hengstler, Jan Georg; Wehner, Frank
Autophagy is an intracellular bulk degradation process of cytoplasmic proteins and organelles aimed to preserve cellular homeostasis. It involves the formation of double-membrane structures, called autophagosomes that transport their cargo to the lysosomes where it becomes degraded. The molecular mechanisms underlying induction of autophagy, biogenesis, trafficking and turnover of autophagosomes have been extensively studied. However, the regulation of these steps by signaling pathways that adjust the autophagy flux to different cellular stress situations is still poorly understood. The aim of this work was to investigate the regulation of autophagy upon particular stress conditions in a time-dependent manner. We particularly focused on the control of autophagy by p38. For this purpose we applied a MCF-7/NeuT cell model of oncogene-induced senescence (OIS). In this model, doxycycline-inducible expression of an oncogenic variant of ERBB2 (NeuT) in the breast cancer cell line MCF-7 leads to premature senescence, a process that was shown to be accompanied by aberrant accumulation of autophagic vesicles. We found that autophagy becomes initially induced but that its maturation is later impaired upon oncogenic stress. In addition we identified p38/MAPK as the signaling pathway mediating the block of autophagic flux. This was evidenced by the fact that pharmacological inhibition of p38 by the small molecule compound SB203580 can restore the autophagic flux. This result was confirmed in time-dependent rescue experiments with SB203580. Furthermore, mechanisms by which p38 mediates the autophagic flux blockade were identified. These involved post-translational modifications of the microtubule-associated proteins MAP4 and OP18/STMN1, as well as down regulation of a particular dynein motor protein subunit DYNLL1, which all together provoke microtubule disruption and defective autophagosome transport to the lysosome. The biphasic behaviour of autophagy upon stress (early induction, late block) was confirmed in several cell lines exposed to a different stress-stimulus (anisomycin). Here we could show that also p38/MAPK is involved in these effects in a dual way, with an early induction of initial steps of autophagy and a later block of maturation. In addition, the p38-mediated block of the autophagic maturation was shown to occur via the same mechanism described above.In conclusion, this work revealed new aspects of the control of autophagy by p38 signaling, mainly that the duration and intensity of p38 activation are key determinants of the autophagic flux rate. Low or transitory stress conditions that moderately activate p38 stimulate the autophagic flux. In contrast, more permanent and intensive stress that causes a strong activation of p38 blocks the autophagic flux.
Die Rolle von Mikrotubuli-regulierenden Proteinen während der neuronalen Differenzierung
(2012-07-05) Arens, Julia; Bastiaens, Philippe I.; Wehner, Frank
Während der Entwicklung von Stammzellen in Neuronen verändern sich sowohl die Morphologie als auch die Funktionalität der Zellen. Nach anfänglicher transkriptionsbasierter Reprogrammierung und asymmetrischer Teilung der Vorläuferzellen werden die ersten morphologischen Veränderungen anhand der Initiation von länglichen Zellauswüchsen, den Neuriten, sichtbar, welche im weiteren Verlauf in Axone und Dendriten differenzieren. Während dieser frühen Phasen der neuronalen Morphogenese ist eine Reorganisation des Mikrotubuli-Zytoskeletts zu beobachten, welche den Mikrotubuli eine kritische Rolle in der Initiation und demWachstum von Neuriten nahelegt. In dieser Arbeit wurde die Reorganisation des Mikrotubuli-Zytoskeletts während der neuronalen Differenzierung in P19 Zellen genauer untersucht. In der Literatur sind mehr als 400 Mikrotubuliregulierende Proteine bekannt, welche auf eine mögliche Funktion während der neuronalen Morphogenese untersucht werden sollten. Mittels Phänotyp-basierten High-Content Screens und spezifischem Protein knock down durch RNA-Interferenz wurden Regulatoren des Mikrotubuli-Zytoskeletts identifiziert, welche in die Neuriten Initiation involviert sind. Es konnten drei verschiedene Phänotypen nach Protein Suppression unterschieden werden, bei denen Änderungen in der Neuritenlänge (kürzer oder länger als bei den Kontrollzellen) oder eine Erhöhung des Neuritendurchmessers detektiert wurden.Weitere detaillierte Studien konnten ver- schiedene Untereinheiten des Dynein/Dynactin Motorprotein-Komplexes identifizieren, die in die Neuriten Initiation involviert sind. Außerdem induzierte die Suppression einiger bekannter Mitose- und Zytokinese-Proteine, Eg5 (KIF11), TPX2, INCENP und MKLP1 (KIF23), eine signifikante Erhöhung des Neuritendurchmessers, welche eine mögliche Rolle dieser Regulatoren in der Bündelung von Mikrotubuli suggeriert. Die Mitglieder der EB-Familie binden als +TIPs an wachsende Mikrotubuli-Enden und nehmen Einfluss auf die Stabilität von Mikrotubuli. Anhand der Ergebnisse der High-Content Screens sowie weiterer Studien mit kombinierter Protein Suppression konnten kompetitive Wechselwirkungen der drei Isoformen dieser Familie hinsichtlich des Neuritenwachstums beobachtet werden. Zusammengenommen konnten Regulatoren mit unterschiedlichem Einfluss auf die Dynamik und Organisation von Mikrotubuli identifiziert werden. In einem hypothetischen Modell wird der Einfluss dieser Mikrotubuli-Regulatoren auf die Neuritenbildung vorgestellt.
Die Rolle von Mikrotubuli-regulierenden Proteinen während der neuronalen Differenzierung
(2012-04-20) Arens, Julia; Bastiaens, Philippe I.; Wehner, Frank
Während der Entwicklung von Stammzellen in Neuronen verändern sich sowohl die Morphologie als auch die Funktionalität der Zellen. Nach anfänglicher transkriptionsbasierter Reprogrammierung und asymmetrischer Teilung der Vorläuferzellen werden die ersten morphologischen Veränderungen anhand der Initiation von länglichen Zellauswüchsen, den Neuriten, sichtbar, welche im weiteren Verlauf in Axone und Dendriten differenzieren. Während dieser frühen Phasen der neuronalen Morphogenese ist eine Reorganisation des Mikrotubuli-Zytoskeletts zu beobachten, welche den Mikrotubuli eine kritische Rolle in der Initiation und demWachstum von Neuriten nahelegt. In dieser Arbeit wurde die Reorganisation des Mikrotubuli-Zytoskeletts während der neuronalen Differenzierung in P19 Zellen genauer untersucht. In der Literatur sind mehr als 400 Mikrotubuliregulierende Proteine bekannt, welche auf eine mögliche Funktion während der neuronalen Morphogenese untersucht werden sollten. Mittels Phänotyp-basierten High-Content Screens und spezifischem Protein knock down durch RNA-Interferenz wurden Regulatoren des Mikrotubuli-Zytoskeletts identifiziert, welche in die Neuriten Initiation involviert sind. Es konnten drei verschiedene Phänotypen nach Protein Suppression unterschieden werden, bei denen Änderungen in der Neuritenlänge (kürzer oder länger als bei den Kontrollzellen) oder eine Erhöhung des Neuritendurchmessers detektiert wurden.Weitere detaillierte Studien konnten ver- schiedene Untereinheiten des Dynein/Dynactin Motorprotein-Komplexes identifizieren, die in die Neuriten Initiation involviert sind. Außerdem induzierte die Suppression einiger bekannter Mitose- und Zytokinese-Proteine, Eg5 (KIF11), TPX2, INCENP und MKLP1 (KIF23), eine signifikante Erhöhung des Neuritendurchmessers, welche eine mögliche Rolle dieser Regulatoren in der Bündelung von Mikrotubuli suggeriert. Die Mitglieder der EB-Familie binden als +TIPs an wachsende Mikrotubuli-Enden und nehmen Einfluss auf die Stabilität von Mikrotubuli. Anhand der Ergebnisse der High-Content Screens sowie weiterer Studien mit kombinierter Protein Suppression konnten kompetitive Wechselwirkungen der drei Isoformen dieser Familie hinsichtlich des Neuritenwachstums beobachtet werden. Zusammengenommen konnten Regulatoren mit unterschiedlichem Einfluss auf die Dynamik und Organisation von Mikrotubuli identifiziert werden. In einem hypothetischen Modell wird der Einfluss dieser Mikrotubuli-Regulatoren auf die Neuritenbildung vorgestellt.
The space-time continuum of ras signal transduction pathway
(2011-11-09) Chandra, Anchal; Bastiaens, Philippe; Wittinghofer, Alfred
Die räumliche Aufteilung periphärer Membran-Proteine, wie GNBP (Ras) moduliert deren Spezifität der Signalverarbeitung innerhalb der Zelle. Reversible Palmitoylierung durch Palmitoylacyltransferasen (PATs der DHHC der DHHC Familie) erzeugt die Verteilung von Ras hin zu der Plasma-Membran (PM) über den sekretorischen Weg, indem der entropie-getriebenen Gleichverteilung palmitoylierter Proteine auf alle Zellmembrane entgegenwirkt wird (Rocks et al., 2010). In dieser Arbeit wird beschrieben, dass DHHC-PATs sich nicht durch Substratspezifität auszeichnen und es wird postuliert, dass DHHC Proteine die Palmitoylierungsreaktion nicht katalysieren. Stattdessen verstärken sie die Konzentration des Palmitat- Thioester-Zwischenproduktes und erzeugen auf diese Weise ein zytosolisches Reservoir um Palmitoylierung zu vereinfachen. In dieser Arbeit soll ebenfalls beschrieben werden, wie GSF PDEδ den zügigen Transfer von Ras Protein zwischen PM, Golgi Apparat, endoplasmatischem Retikulum (ER) und Zytoplama unterstützt. Weiterhin wird aufgezeigt werden, dass dies allein solche farnesylierten Ras Proteine betrifft, welche depalmitoyliert oder, im Fall von Ras mit polykationischem Motiv, PM-desorbiert sind. In Verbindung mit dem Palmitoylierungskreislauf wirkt PDEδ, indem es die Diffusion von depalmitoyliertem Ras vereinfacht und erlaubt so dessen kinetisches Eingefangenwerden am Golgi Apparat ermöglicht. Andererseits erhöht die Solubilisierung von Kras, welches ein polybasisches Segment auszeichnet, weg von Endomembranen die Geschwindigkeit, mit der Kras von der PM wieder eingefangen werden kann, wodurch dessen Equilibriumsverteilung aufrecht erhalten wird. Dies ist wichtig, da PDEδ auf diese Art die durch Ras vermittelte Signaltransduktion verstärkt, indem es die Ras-Konzentration an der PM erhöht, und im Gegenzug bewirkt das Herunterregeln von PDEδ ein Unterdrücken von regulierten und onkogenischen Ras Signalen. Zusätzlich wird die Regulierung von farnesyliertem Ras*PDEδ Einheiten via G-Protein Arl2/Arl3 auf eine GTP-abhängige Art beschrieben. Diese Erkenntnis deckt einen von PDEδ-abhängigen Mechanismus auf, der für die räumliche Organisation von Ras Proteinen in Zellmembranen verantwortlich ist und dessen Einfluss auf das Signalverhalten von Ras Wildtyp- bzw. mutierter Form.
The acylation cycle
(2011-04-15) Vartak, Nachiket; Bastiaens, Philippe; Waldmann, Herbert
Innerhalb von Zellen ist die Verteilung von Proteinen häufig präzise, das bedeutet mit spezifischer Anreicherung in verschiedenen intrazellulären Kompartimenten. Als Ursache solcher Verteilungen wurden bereits Interaktionen, Rezeptoren oder auch Signalsequenzen beschrieben. In dieser Arbeit wird die Entstehung einer räumlich inhomogenen Proteinverteilung innerhalb von Zellen beschrieben – "Acylation Cycle" genannt - die auf einem Reaktions-Diffusions-Prozess basiert, welcher die reversible SPalmitoylierung umfasst. Palmitoylierung läuft am Golgi-Apparat ab, wobei die dort lokalisierten Enzyme kaum oder keine Spezifität für ein konkretes Proteinsubstrat zeigen. Anscheinend benötigen DHHC-Palmitoyltransferasen zur Palmitoylierung lediglich einen membrannahen Cysteinrest. Den gerichteten Transport zur Plasmamembran ermöglicht der sekretorische Weg. Der "Acylation Cycle" wirkt der entropie-getriebenen Homogenisierung palmitoylierter Proteine im Zellvolumen entgegen. Weiterhin wird die Aufenthaltsdauer palmitoylierter Proteine, wie z.B. Ras, an der Plasmamembran durch die Kinetik des "Acylation Cycle" beeinflusst, wodurch auch die Menge an Ras, die dem MAPK-Signalweg zur Verfügung steht, verändert wird. Das Unterbrechen des "Acylation Cycle" durch den neuartigen Inhibitor Palmostatin B bewirkt die durch Entropie getriebene Umverteilung von Ras. Durch Palmostatin B-Behandlung wird die Ras-Signalaktivität nach EGF Stimulierung an der Plasmamembran von der Aktivität am Golgi Apparat entkoppelt. Letztendlich führt die Palmostatin B-Behandlung von mit onkogenem HRasG12V transformierten MDCK Zellen zu einer Unterdrückung ihres konstitutiv-aktiven MAPKSignals, welches zur Zellteilung führen kann und verursacht so die Reversion des Phänotyps zu einem der untransformierten MDCK Zellen sehr ähnlichen. Der "Acylation Cycle" ist ein Phänomen, dem viele Proteine unterworfen sind und bietet daher die Gelegenheit die Modulation von Signalaktivitäten therapeutisch auszunutzen.
Synthese und Funktion von Thiostreptonderivaten
(2010-11-19) Schoof, Sebastian; Waldmann, Herbert; Engelhard, Martin
Die Thiopeptid-Naturstoffe sind eine Gruppe von strukturell komplexen, makrozyklischen Peptiden, die sehr hohe Wirkung gegen Gram-positive Bakterien aufweisen. Die potentesten Vertreter stellen sub-nanomolare Hemmstoffe der GTPase-assoziierten Region des Ribosoms dar. Diese Region ist für die dynamische Interaktion des Ribosoms mit verschiedenen Proteinfaktoren während des Translationszyklus essentiell, so dass ihre Inhibierung zum Abbruch des Translationsvorgangs und Absterben der Bakterien führt. Die Thiopeptidbindestelle der GTPase-assoziierten Region zeichnet sich strukturell und funktional durch das enge Zusammenwirken von Protein- und RNAKomponenten aus. Die Thiopeptide wechselwirken hier kooperativ mit dem L11-Protein und mit der 23S rRNA. Mit dieser Eigenschaft stellen sie eine Besonderheit unter den antibakteriellen Hemmstoffen dar. Bislang sind nur wenige Beispiele von Inhibitoren bekannt, die gleichzeitig mit Protein- als auch mit RNA-Komponenten wechselwirken. Die Bindestelle der GTPase-assoziierten Region des Ribosoms wird derzeit von keinem therapeutisch eingesetzten Antibiotikum ausgenutzt. Ein detaillierteres Verständnis der Bindeeigenschaften kann daher zur Entwicklung von neuen ribosomalen Wirkstoffen beitragen.
Wechselwirkungen zwischen Adenylierungs- und Peptidyl Carrier Protein-Domänen in nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen sowie biochemische und strukturelle Untersuchungen zu gespaltenen Inteinen
(2010-09-07) Zettler, Joachim; Mootz, Henning D.; Engelhard, Martin
Die aktuelle Antibiotikaforschung basiert trotz großer Fortschritte auf dem Gebiet der kombinatorischen, organischen Synthese immer noch zu einem großen Teil auf Naturstoffbibliotheken bakteriellen oder pilzlichen Ursprungs. Innerhalb dieser Naturstoffe sind nichtribosomale Peptide (NRPs) eine enorm wichtige bioaktive Substanzklasse. Neben antibiotischen Eigenschaften können sie weiterhin immunsuppressive, antifungale und tumorunterdrückende Aktivität entfalten. NRPs werden von Multi-Domänen Proteinen den so genannten nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) in einer Art Fließbandmechanismus aufgebaut. Zwar sind die individuellen NRPS-Domänen biochemisch und strukturell sehr gut untersucht, jedoch sind die für das detaillierte Verständnis der Naturstoffbiosynthese essentiellen Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Domänen sowohl strukturell, als auch mechanistisch noch kaum verstanden. In dieser Arbeit gelang der erste experimentelle Nachweis von Interaktionen zwischen einer Adenylierungs- mit einer in cis vorliegenden Peptidyl Carrier Protein-Domäne aus einem NRPS Initiationsmodul. Mit biochemischen Methoden, wie partiellen tryptischen Verdauen, Gelfiltrationschromatographie und chemischen Markierungsassays, wurde festgestellt, dass der 4’-Phosphopantetheinarm der PCP-Domäne sich in unterschiedlichen Positionen während des Katalysezyklus befindet und zwar abhängig vom Zustand der Adenylierungs-Domäne. Die produktive Wechselwirkung zwischen den beiden Domänen benötigt sowohl eine post-translational modifizierte holo-Peptidyl Carrier Protein-Domäne, als auch eine spezielle Konformation der Adenylierungs-Domäne, die Thioesterkonformation. Die hier durchgeführten Studien charakterisieren erstmalig die großen konformationellen Bewegungen in NRPS-Proteinen und sollten den Startpunkt für ein tiefgreifendes Verständnis des antibiotika-produzierenden Proteintemplats bilden. Für die Untersuchung von Proteinstrukturen und -dynamiken mit spektroskopischen Methoden, wie der NMR- oder der Fluoreszenzspektroskopie, ist die Modifikation des zu untersuchenden Proteins mit biophysikalischen Sonden oft unvermeidlich. Für den gezielten Einbau dieser Sonden in Proteine sind, unter anderem, gespaltene Inteine ein wichtiges Werkzeug der Chemischen Biologie. Die von gespaltenen Inteinen vermittelte Protein trans- Spleißreaktion verbindet die N- und C-terminal zu den individuellen Inteinhälften vorliegenden Polypeptidsequenzen, die N- und C-Exteine, über eine native Peptidbindung und erlaubt damit den definierten Aufbau eines Proteins aus mehreren Segmenten. Mit dem natürlich gespaltenen DnaE Intein aus Nostoc punctiforme (Npu) wurde in dieser Arbeit das bisher schnellste trans-spleißende Intein biochemisch mit gereinigten Proteinen charakterisiert. Neben der hohen monomolekularen Reaktionsrate von 1,1 ± 0,2 s-1 bei 37°C zeigte es mit verschiedenen Exteinsequenzen robuste Spleißausbeuten von 50 - 90% in dem Temperaturbereich von 6 bis 37°C. Als ein Grund für verminderte Spleißausbeuten konnte die Bildung von löslichen Aggregaten der individuellen Inteinhälften nachgewiesen werden. NMR-Untersuchungen ergaben, dass sowohl die natürlich gespaltenen individuellen Hälften des Npu DnaE Inteins, als auch die des künstlich gespaltenen Synechocystis species PCC6803 DnaB Inteins keine definierte Faltung ohne das Partnerprotein aufwiesen. Für erstere konnte bei Komplexbildung der Hälften und nach der Spleißreaktion der Übergang in eine gefaltete Konformation nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde mit dem SPLICEFINDER-System eine Methode entwickelt, die es schnell und unkompliziert erlaubt parallel mehrere Insertionspositionen von gespaltenen Inteinen in Zielproteinen auf ihre Spleißaktivität zu überprüfen. Für eine Anwendung dieses Systems, der segmentellen Isotopenmarkierung von Proteinen für NMR-Untersuchungen, konnte ein einfaches Verfahren zur Bestimmung der Markierungseffizienz etabliert werden. Es ist anzunehmen, dass die in dieser Arbeit durchgeführten Studien zu gespaltenen Inteinen deren Einsatzbreite für die selektive Modifikation von Proteinen signifikant erhöhen werden.
Etablierung zellulärer Testsysteme zur Identifikation von Molekülsonden für chemisch-genetische Untersuchungen
(2009-06-09T11:45:58Z) Menninger, Sascha; Waldmann, Herbert; Goody, Roger S.

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